研究背景经皮给药系统(TDDS)是指在皮肤表面给药,使药物由完整皮肤外侧吸收进入血液或皮下各层组织,发挥全身或局部治疗作用的一种制剂或系统。经皮给药制剂通过皮肤给药,能够避免肝脏的首过效应和胃肠道内酶的破坏,长时间保持有效药物浓度,延长给药时间,减少给药次数,提高药物疗效。而且经皮给药制剂使用方便,能够提高病人的依从性。皮肤局部用制剂是指以皮肤为靶器官,将药物传递到局部而非全身,从而达到治疗皮肤局部性疾病的一种制剂。包括散剂、软膏剂、溶液剂、气雾剂以及新型的传递系统,如脂质体、微乳等。这类制剂的制备大多是在外用制剂制备工艺的基础上,通过改进制备工艺、添加不同的辅料、选择理想的基质等方法,增加药物的皮肤滞留量,从而达到增强药效的目的。对于治疗皮肤局部性疾病的制剂而言,药物在皮肤内的滞留量和渗透速率是非常重要的指标。药物进入皮肤内的量越多,在皮肤内的浓度越高,越有利于发挥药物的治疗效果。而渗透经过皮肤吸收进入体循环的药物则进入非治疗部位,产生副作用。控制药物在皮肤表面的释放速度能够增加药物在皮肤中的滞留量,减少其进入体循环的最。很多的皮肤给药制剂能够通过皮肤很好的发挥全身作用,但是控制药物的释放速度发挥皮肤局部治疗作用的制剂却很少。因此,研究一种新型的皮肤靶向给药制剂,提高药物在皮肤局部的滞留量和滞留时间,减少药物进入体循环的量,对于治疗皮肤局部性疾病具有重要意义。微海绵是近几年发展起来的一个用于缓释给药的新型给药技术,在控制药物释放速度以及部位方面显示出较大的优势。同时,微海绵还能够提高难溶性药物的溶解速率,增加难溶性药物的生物利用度。将药物制备成微海绵制剂,还能够控制药物的释放速度,减少药物用量,降低副作用。另外,微海绵制剂还能够提高药物在制剂中的稳定性。丹皮酚是中药牡丹皮的有效成分,具有多种临床疗效,在亚洲和欧洲国家广泛使用。丹皮酚能够降低大脑形态学的损伤,增加神经元的再生性,减少脑梗塞的发生,从而起到治疗神经退行性疾病的作用;丹皮酚还具有抗动脉硬化和抗心律不齐的作用,广泛应用于心血管疾病的治疗;此外,丹皮酚还具有抗肿瘤,抗变态反应和抑制黑色素分泌的作用。最近的报道指出,丹皮酚还能够调节组胺和免疫球蛋白E(IgE)的释放,从而起到治疗湿疹的作用。但是,丹皮酚在水中的溶解度较低,限制了丹皮酚的使用。而且丹皮酚难以透过皮肤角质层,添加透皮吸收促进剂虽然能够增加丹皮酚透过角质层的能力,但是同时丹皮酚也容易进入体循环产生副作用。对于治疗湿疹等皮肤性疾病,药物在皮肤中需要达到一定的浓度才能发挥药效。因此,丹皮酚在治疗局部皮肤病时,不能达到理想的治疗效果,可能不是药物本身的原因,而是丹皮酚不能到达治疗部位,达到有效药物浓度。同时,丹皮酚进入到血液后会对肝药酶产生作用,影响其他药物的代谢。因此,开发一种新型的丹皮酚制剂,增加丹皮酚在皮肤中的滞留量,同时降低丹皮酚进入体循环的量,对于治疗湿疹等皮肤性疾病具有重要意义。将丹皮酚制备成经皮给药制剂用于治疗皮肤病,既克服了传统激素类药物副作用大的缺点,又具有作用时间长、使用方便,病人依从性好等优点。目前已有用于治疗湿疹等皮肤炎症反应的丹皮酚软膏上市。但是治疗效果并不是很理想。为了提高丹皮酚在皮肤局部的生物利用度,还需要进一步对丹皮酚的制剂进行研究。将丹皮酚制备成脂质体,用于皮肤局部给药,能够达到提高生物利用度的目的,但是脂质体的制备工艺较复杂,费用高,难以实现工业化大生产。而且也没有报到指出,制备的脂质体在室温下的稳定性问题。将丹皮酚制备成微乳,也能够提高丹皮酚的皮肤局部生物利用度,但是微乳的制备过程中,需要填加很多的表面活性剂和助表面活性剂,对皮肤的刺激性大。因此有必要开发一种新型的丹皮酚皮肤靶向给药制剂用于皮肤局部疾病,提高丹皮酚的局部生物利用度,降低副作用。研究目的开发一种新型的皮肤靶向给药制剂——丹皮酚微海绵制剂,提高丹皮酚的皮肤滞留量以及其透过角质层的能力,减少其进入体循环的量,进而提高丹皮酚的局部生物利用度,降低副作用。建立适合本课题的丹皮酚及其制剂的含量测定方法,为丹皮酚微海绵制剂和丹皮酚普通制剂的体外释药行为和体内药动学研究提供参考。本课题以丹皮酚为模型药物,研究微海绵制剂对局部告物利用度的影响,从而为丹皮酚新型靶向给药制剂的研究奠定基础,同时探索微海绵制剂与中药的适宜性研究,为中药原材料的制剂研究提供参考。研究方法1.丹皮酚微海绵的处方前研究采用全波长扫描确定丹皮酚的检测波长,选择合适的色谱条件,建立丹皮酚的含量测定方法;采用正辛醇-水系统,对丹皮酚的油水分配系数进行考察;为了选择合适的体外透皮接收液,考察丹皮酚在不同溶剂中的平衡溶解度。2.丹皮酚微海绵的制备工艺研究采用星点设计-效应面法优选丹皮酚微海绵的制备工艺和处方组成,以聚乙烯醇1788(PVA1788)含量,丹皮酚/乙基纤维素比例和搅拌速度为考察因素,以得率、药物包封率和反映微海绵粒径分布均匀性的分散系数为效应值,采用Design-Expert8.0软件进行三因素五水平的实验设计并且对实验结果进行分析,建立各个因素对效应值影响的三维面图和平面图,建立模型拟合方程,优选最优制备工艺。用H-3000N扫描电镜对所形成的丹皮酚微海绵进行形态观察,用Mastersize 2000激光衍射粒度分析仪对丹皮酚微海绵的粒度大小和粒度分布均匀性进行测定。3.丹皮酚微海绵软膏的制备及理化性质的考察采用乳化法制备丹皮酚微海绵软膏和丹皮酚普通软膏,采用HPLC法对制备的软膏进行含量测定,建立软膏中丹皮酚的检测方法。对所制备的丹皮酚微海绵软膏和丹皮酚普通软膏进行理化性质的考察和稳定性考察。4.丹皮酚微海绵软膏的体外释药行为研究体外释药实验中,采用Franz扩散池,考察裸鼠皮肤表面分别给予1g丹皮酚微海绵软膏或1g丹皮酚普通软膏后,丹皮酚皮肤渗透行为的差异。采用生理盐水作为接收液,用HPLC法测定接收液中丹皮酚含量,计算其渗透速率。将药物的累积透过量对时间作图,拟合丹皮酚从不同剂型中释放的透过曲线图。采用不同的模型拟合方程,对丹皮酚微海绵软膏和丹皮酚普通软膏的药物释放行为进行分析。同时分别测定体外透皮实验4h、8h、12h和24h后皮肤中丹皮酚滞留量,比较丹皮酚微海绵软膏组和丹皮酚普通软膏组中丹皮酚在皮肤中滞留量的差异。5.丹皮酚微海绵软膏在体药动学研究大鼠麻醉后分别在大鼠颈静脉和腹部真皮层埋入微透析探针,以空白生理盐水为灌流液,灌流速度为5μL·min-1,平衡1h后,在大鼠腹部剃毛区域涂抹1g丹皮酚软膏或1g丹皮酚微海绵软膏,并同时收集透析液,每隔20min收集一管,共收集12h,得到的透析液用HPLC法测定药物的浓度。采用PKSolver软件,对丹皮酚普通软膏和丹皮酚微海绵软膏的局部药动学和整体药动学参数进行分析,考察微海绵制剂对丹皮酚局部生物利用度的影响。6.丹皮酚微海绵软膏药效学实验研究采用2,4-二硝基氯苯致敏的大鼠背部湿疹模型,观察丹皮酚微海绵软膏对湿疹皮肤的治疗作用,采用组织学方法观察大鼠背部皮肤组织在不同时间点的病理学改变。7.丹皮酚微海绵软膏的皮肤刺激性试验采用家兔皮肤刺激性试验,评价丹皮酚微海绵软膏的安全性。分别观察单次给药和多次给药后,丹皮酚微海绵软膏和空白软膏对于家兔背部完整皮肤和破损皮肤的刺激性,观察皮肤有无红斑和水肿情况,以及上述状况的恢复情况及时间。研究结果1.丹皮酚微海绵处方前研究通过全波长扫描,确定丹皮酚的检测波长为276nm。建立的丹皮酚HPLC色谱条件为:Thermo Syncronis C18 柱(250mm×4.6mm,5μm),流动相为甲醇:水(65:35),检测波长为276nm,流速为1mL.min-1,柱温为25℃。对其进行方法学考察,建立的以甲醇为溶剂的标准曲线为y=4.6465x-28.817,相关系数R2=0.9993,丹皮酚在10～1000μg·mL-1浓度范围内,与峰面积呈良好的线性关系。以生理盐水为溶剂的标准曲线为y=64.475x-4.9966,相关系数R2=0.9998,丹皮酚在0.25～100μg·mL-1浓度范围内,与峰面积呈良好的线性关系。丹皮酚的油水分配系数为1.026,因此丹皮酚在体外扩散实验中具有较好的皮肤扩散性能。丹皮酚在不同溶剂中的平衡溶解度没有显著性差异,用生理盐水作为接收液时,能够达到漏槽条件,满足透皮实验的要求。2.丹皮酚微海绵的制备工艺研究最优工艺的选择是以最高得率,最高药物包封率和最小分散系数为筛选指标,采用Design-Expert 8.0软件,得出最优处方的条件分别是:PVA的含量为2.84%,丹皮酚/乙基纤维素的比例为6.88:1,转速为1000rpm。根据最优工艺,得到的微海绵得率为68.86±4.64%,药物包封率为55.90±3.27%,分散系数为0.732±0.067,分散系数在0.50～1.00的范围内,表明粒径分布均匀。建立模型拟合方程的归一值为0.861,表明测得的效应值接近预测值。因此通过设计方案建立的数学模型优选丹皮酚微海绵的最优制备工艺,是有效可靠的。用扫描电镜对形成的丹皮酚微海绵进行形态学观察,微海绵是一种粒径分布比较均匀,球状多孔结构,球表面和内部有很多孔组成,球表面没有药物结晶存在。用激光衍射粒度分析仪测得微海绵表面积平均粒径为10.23±0.74μm,体积平均粒径为23.27±0.76μm。3.丹皮酚微海绵软膏的制备及理化性质考察丹皮酚微海绵软膏的制备采用乳化法。HPLC法确定的软膏中丹皮酚的含量测定方法为:Thermo Syncronis C18 柱(250mm×4.6mm,5μm),甲醇-水(65:35),检测波长为276nm,流速为1mL·min-1,柱温为25℃。本方法专属性强,重现性好(RSD=2.74%),回收率高(101.27%,RSD=2.39%),稳定性强(RSD=2.51%)。测得的丹皮酚微海绵软膏的平均含量为0.0732g/g,丹皮酚普通软膏的平均含量为0.0726g/g。制备的丹皮酚微海绵软膏和丹皮酚普通软膏均匀、细腻,具有适当的黏稠性,易涂布于皮肤或黏膜上,无刺激性。在实验期间,软膏无酸败、变色、分层等变质现象。在温度为40℃±2℃,相对湿度75%±5%环境中,放置3个月,在实验期间第0、1、2、3月末取样,对软膏进行加速稳定性考察,结果表明所制备的的丹皮酚微海绵软膏和丹皮酚普通软膏是稳定的。4.丹皮酚微海绵软膏的体外释药行为研究比较丹皮酚微海绵软膏和丹皮酚普通软膏的经皮渗透曲线可知,丹皮酚自制剂中的释放均符合零级动力学方程,其中丹皮酚普通软膏的渗透速率为17.12±0.30μg·cm-2·h-1;丹皮酚微海绵软膏的渗透速率为21.21±1.11μg·cm-2·h-1。微海绵软膏的渗透速率明显高于丹皮酚普通软膏(P=0.004)。测定丹皮酚微海绵软膏组和丹皮酚普通软膏组在不同时间点的皮肤滞留量,在各个时间点,丹皮酚微海绵软膏的皮肤滞留量明显高于丹皮酚普通软膏组。测定结果分别为:4h,0.32±0.006 mg·cm-2、0.57±0.04 mg·cm-2;8h,0.55±0.005 mg·cm-2、0.69±0.07 mg·cm-2;12h,0.76±0.10 mg·cm-2、0.98±0.27 mg·cm-2;24h,1.00±0.08 mg cm-2、1.36±0.07 mg·cm-2。5.丹皮酚微海绵软膏在体药动学研究对丹皮酚微海绵软膏组和丹皮酚普通软膏组真皮层组织液和血液中的药物进行药动学分析。对于真皮层组织液,丹皮酚微海绵软膏组的药时曲线下面积(2395.7±258.22μg.mL-1.min-1)明显高于丹皮酚普通软膏组(1586.8±307.97μg·mL-1·mm-1)(P=0.025),丹皮酚微海绵软膏组的药物达峰时间为220min,明显短于丹皮酚普通软膏组(480min),丹皮酚微海绵软膏组的药物消除时间为935.1min,比丹皮酚普通软膏组消除时间(548.6min)长将近两倍;而对于血液中丹皮酚微海绵软膏组的药时曲线下面积(AUC0～t,270.11±14.10μg·mL-1·min-1)和达峰浓度(Cmax,0.636± 0.041 μg·mL-1)却只有丹皮酚普通软膏组的一半(AUC0～t,656.72±153.26 μg.mL-1·min-1 和 Cmax,1.145±0.213μg·mL/1)。两组之间的药动学参数均具有显著性差异(P值分别为0.048和0.049)。因此丹皮酚微海绵软膏提高了药物的局部生物利用度,降低了药物副作用。6.丹皮酚微海绵软膏药效学实验研究大鼠背部皮肤组织的病理学切片显示,丹皮酚微海绵软膏组的皮肤与阴性对照组相比,角质层较薄,表皮细胞内、细胞间水肿减轻,炎症细胞浸润数减少。因此丹皮酚微海绵软膏对于湿疹能够起到很好的治疗作用。7.丹皮酚微海绵软膏的皮肤刺激性试验家兔皮肤刺激性试验研究表明,丹皮酚微海绵软膏和空白软膏对家兔完整皮肤的刺激分值均为0,对家兔破损皮肤的刺激分值分别为0.17和0.33,正常皮肤和破损皮肤都未见红斑和水肿情况。表明丹皮酚微海绵软膏对家兔皮肤没有刺激性。结论1.丹皮酚处方前研究表明,建立的含量测定方法线性关系良好,精密度高,准确度高,稳定性强。丹皮酚的油水分配系数表明其具有良好的皮肤扩散性能,丹皮酚在生理盐水中平衡溶解度能够满足其进行体外透皮实验的要求。2.丹皮酚微海绵制备工艺研究表明,本课题采用的星点设计-效应面法能够很好的筛选丹皮酚微海绵的制备工艺,得到的三维效应面图和平面图能够直观的反映PVA含量、丹皮酚和乙基纤维素比例及搅拌速度三个因素对微海绵得率、药物包封率和粒径分布均匀性的影响。3.丹皮酚微海绵软膏理化性质的研究表明,所制备的软膏在3个月内稳定性。4.体外释药行为研究表明,将丹皮酚制备成微海绵制剂,能够提高丹皮酚透过角质层的渗透速率,增加药物的皮肤滞留量,且药物持续释放时间长达12h。5.在体药动学研究表明,丹皮酚微海绵制剂能够提高丹皮酚的皮肤局部生物利用度,减少副作用。药物持续释放时间长达12h,从而使药物能够在皮肤长时间保持有效药物浓度。因此丹皮酚微海绵制剂在治疗皮肤局部性疾病方面能够达到很好的治疗效果。6.药效学研究表明,丹皮酚微海绵制剂能够减少炎症反应的发生,对湿疹具有很好的治疗作用。7.家兔皮肤刺激性实验表明,丹皮酚微海绵软膏对家兔皮肤没有刺激性。