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在脊椎动物胚胎发育过程中,位于组织者处的信号中心对于胚胎体轴和胚层的形成具有重要作用。组织者的形成需要诸多因子协同作用,如局域具有活性的Wnt/β-catenin信号通路、Nodal信号通路以及Nodal信号通路的抑制因子Lefty等。文昌鱼是无脊椎动物到脊椎动物的过渡类群,已有研究表明在原肠胚期,文昌鱼的背唇结构与脊椎动物的组织者同源,但其发育机制和功能尚不清楚。文昌鱼是体外受精,胚胎发育过程简单,且具有与脊椎动物相似的体轴结构,但其结构较脊椎动物简单,因此便于对基因在胚胎发育中的功能进行研究。文昌鱼Lefty基因是最早表达在将来发育为组织者区域的基因,因此研究文昌鱼Lefty基因在胚胎发育中的功能对研究组织者的发育机制及功能提供帮助。本文首先对文昌鱼Lefty基因在不同发育时期的空间表达谱进行了系统的研究,结果显示,文昌鱼Lefty基因为非母源性表达,32-细胞时期在胚胎的植物极细胞内启动合子表达,随后在64-细胞和128-细胞时期也都表达在一部分植物极细胞内,在原肠胚期,Lefty基因集中表达在文昌鱼胚胎背唇处,在神经胚早期,该基因主要集中表达在背部中央的外胚层和中胚层组织,而在后端胚孔处的表达消失,待胚胎发育至神经胚早中期,主要表达在胚胎左侧前部和中部的背神经板、体节中胚层和咽区内胚层,在神经胚中期,Lefty基因在背部的表达逐渐减弱,主要在左侧前端咽区和后端尾芽处表达,待胚胎发育至神经胚晚期,Lefty基因在背部的表达完全消失,主要表达在胚胎左侧的内柱和棒状腺原基位置以及左侧尾芽的体节中胚层和肠道内胚层,幼体时期Lefty基因在内柱和棒状腺处的表达消失,仅在左侧尾芽的体节中胚层和肠道内胚层表达。为了进一步研究文昌鱼Lefty基因在胚胎发育中的功能,本文采用过表达、敲除和挽救3种途径对该基因进行详细地研究。首先,我们通过注射文昌鱼Lefty mRNA进行基因过表达研究,结果显示,过表达Lefty基因后,胚胎在进入原肠胚晚期后出现形态异样的表型,主要表现为:原肠胚晚/神经胚早期的胚胎背部预定神经板区域无法变平,自神经胚中期后,胚胎前端器官和背部组织(神经管、脊索、体节)消失,至幼体时期,口、鳃裂及咽部前部器官均不能形成,随后由于胚胎严重畸形而逐渐死亡。此外,我们还进一步检测了过表达文昌鱼Lefty基因后胚胎发育相关基因的表达情况,结果显示,原肠胚期组织者基因(Nodal和Vg1)、背部发育相关基因(Gsc和Chordin)和前端发育相关基因(FoxQ2和Cer)的表达量均下降,甚至一些基因的表达完全消失,而腹部(EvxA)和后端(Wnt8)的标记基因表达向背部扩张,神经外胚层(Sox1/2/3)和体节中胚层(Six1/2)的标记基因表达消失,而表皮外胚层(AP2)的标记基因表达范围扩张。其次,本文通过TALEN技术敲除文昌鱼Lefiy基因后,发现胚胎出现了与过表达文昌鱼Lefty基因相反的表型,主要表现在:在神经胚早期,部分胚胎出现异常的形态,背部神经板中间弯曲,腹部形态正常,随着胚胎发育,出现前端膨大,背部体节明显,后端腹侧消失的表型,待胚胎发育至幼体时期,前端腹侧的吻体腔消失,口前窝明显增大,且左右两侧各形成一个口前窝和口,内柱和棒状腺向腹侧突出,鳃裂不能正常形成,后端腹侧的肠道消失,由于胚胎严重畸形导致胚胎逐渐死亡,最多仅能存活一周左右。同时,我们还检测了敲除文昌鱼Lefty基因后与胚胎发育相关基因在早期的表达情况,结果显示,与组织者(Nodal和Vg1)、背部(Gsc和Chordin)和前端(Cer)发育相关基因的表达明显上升,且表达范围扩大,而腹部(EvxA)和后端(Wnt8)发育相关基因表达明显下降,且表达范围缩小,神经外胚层(Sox1/2/3)和体节中胚层(Six1/2)标记基因的表达范围明显增大,而表皮外胚层标记基因(AP2)的表达消失。最后,为了探究文昌鱼Lefty基因是否通过抑制Nodal信号通路调控胚胎发育,我们采用共注射Lefty mRNA和Nodal信号通路激活剂Vg1mRNA的方法,观察过表达Lefty基因后的胚胎表型能否被Vg1所挽救,结果显示,共注射文昌鱼Lefty mRNA和Vg1mRNA后,胚胎背部和前端组织得到了恢复,并且原位杂交的结果也显示,在原肠胚期,组织者中心的组织者基因Nodal和与背部发育相关基因GSC的表达部分恢复正常,在神经胚中期,背部脊索的标记基因Brachyury的表达也基本恢复正常,说明文昌鱼Lefty基因过表达后的表型能够被Vg1挽救。由此可以说明,在文昌鱼中最早表达在组织者区域的Lefty基因通过抑制Nodal信号通路调控胚胎组织者和体轴的发育。此外,为了探究文昌鱼Lefty基因的合子表达是否受到Nodal信号通路调控,本文在封闭或过度激活Nodal信号通路后,检测胚胎早期Lefty基因的表达情况,结果发现封闭Nodal信号通路后导致Lefty基因在胚胎发育早期未能启动表达,而促进Nodal信号通路后,Lefty基因在早期的表达量升高,并且表达范围扩大。综合以上结果说明文昌鱼Lefty基因的合子启动由Nodal信号激活,并且文昌鱼Lefty基因通过反馈抑制Nodal信号通路调控胚胎发育。