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虎(Panthera tigris)是全球遗传资源多样性保护的旗舰物种。在生态系统中,是食物链的顶级掠食者。东北虎(Panthera tigris altaica)曾广泛分布在中国的东北,俄罗斯远东地区和朝鲜半岛,在最近几十年里,由于栖息地丧失、偷猎、猎物耗竭和疾病等原因,它们经历了严重的数量下降和地理分布范围收缩。目前小于600的个体估计保持在俄罗斯的锡霍特山脉(95%)和中俄边境的长白山脉(5%)。2016中国政府发起虎豹国家公园(TLNP)计划,旨在中国扩大东北虎和豹的范围。在对东北虎进行生态性宏观保护(如恢复野生种群、栖息地连通、猎物增加和降低人的干扰等)的同时,利用现代分子细胞生物学、生物信息学和高通量测序等技术手段开展对东北虎遗传资源的收集、整理,保存、分析和利用,逐渐成为东北虎科学保护研究的热点。本研究利用高通量测序技术对东北虎肺转录组中的miRNA和mRNA表达谱进行分析研究;从肺miRNA表达谱中分析获得东北虎miR-302/367序列;利用CRISPR/dCas9-VPR系统激活东北虎成纤维细胞中miR-302/367的表达,并将其诱导成为iPSCs等,主要获得以下研究结果:1我们利用高通量测序技术对东北虎肺中的small RNA进行分析,将处理获得的clean reads与NCBI数据库中下载的东北虎基因组数据进行比对、注释和表达量分析。成功获得东北虎肺miRNA的表达谱,其中包括225个已知的miRNA和44个新的miRNA。接下来我们利用Targetscan和miRanda软件对分析获得的miRNA进行了靶基因预测,对预测获得的靶基因进行GO分析,共分为402个GO terms。我们意外发现在东北虎肺中低表达能提高体细胞重编程效率的miR-302/367的2个成员,为利用miR-302/367 将东北虎成纤维细胞重编程为 iPSCs 做好理论基础。2我们同时对东北虎肺转录组中的mRNA进行了 GO、COG和KEGG分析,GO分析发现9176个unigenes被成功注释到58个GO terms,58828个unigenes被COG注释和分类,18546个unigenes被注释到KEGG的309个pathway,在富集分布的10个通信号路有5个通路是与抵抗疾病感染密切相关的。我们对转录组中的miRNA的靶基因和mRNA表达进行关联分析获得了 1861个基因交集,并对这个交集进行了 KEGG分析发现显著富集的pathway集中在癌症和病毒感染等疾病相关通路和参与细胞增殖、分化相关的信号通路。这些信号通路阐述了 miRNA调控靶基因实现肺生物学功能的分子调控网络。我们同时绘制了 miRNA通过调控PI3K/Akt信号通路调节细胞增殖的网络调控图。3对东北虎miR-302/367前体序列及其启动子区域进行预测分析,获得了剩余3个miR-302/367成员的序列,利用生物信息学软件分析miR-302/367启动子区获得具有靶向miR-302/367启动子区域的4个sgRNA,人工合成后连接到sgRNA慢病毒表达载体上,构建4个sgRNA慢病毒表达载体。对dCas9-VPR和sgRNA表达载体进行慢病毒包装和浓缩,之后感染东北虎成纤维细胞,72h后收集细胞,qRT-PCR检测miR-302/367的表达,发现5个miRNA表达量增加5～20倍,达到在东北虎成纤维细胞内性激活miR-302/367表达的目的。4将包装好的dCas9-VPR和sgRNA慢病毒添加到生长状态良好的东北虎成纤维细胞中,激活内源性表达miR-302/367,进行iPSCs诱导,7d后可以在倒置显微镜下观察到细胞克隆。利用免疫荧光技术、qPCR技术检测发现Oct4、Sox2、Nanog等多能性干细胞表面标志物在诱导的细胞中表达;同时qPCR检测到miR-302/367在重编程过程中稳定表达。此外进行染色体核型分析发现重编程获得的细胞无遗传变异;碱性磷酸酶染色呈阳性;能诱导分化成为表达肝糖原和Alb肝细胞特异标志物的肝细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和外周神经元细胞,证明了具有向三个胚层定向诱导分化的能力。综上所述,本研究通过对东北虎肺进行转录组测序,分析了转录组中的miRNA和mRNA表达谱,并对两者进行关联分析揭示东北虎肺中miRNA与mRNA调控网络。我们对测序数据分析预测后,获得了东北虎miR-302/367的序列和结构,并构建了靶向其启动子的sgRNA慢病毒表达。利用dCas9-VPR在东北虎成纤维细胞中激活内源性miR-302/367 的稳定表达,将东北虎成纤维细胞重编程为 iPSCs。获得的东北虎 iPSCs 可作以为胚胎发育的研究模型,可以作为遗传资源长期保存,可以进行嵌合体研究。为虎的科学保护提供了良好的研究基础。