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碱性蛋白酶是指最适反应pH值在碱性范围内水解蛋白质肽键的酶类,研究表明大部分碱性蛋白酶都是丝氨酸蛋白酶,少部分为金属蛋白酶,碱性蛋白酶在洗涤剂、制革、丝绸、医药、食品、饲料、环保、废物处理等化学工业和基础研究领域有广泛的应用,有统计表明碱性蛋白酶销量占所有工业酶销量的25%左右。由微生物来源的碱性蛋白酶大部分都是胞外酶,适合工业化生产,其具有培养简单、价格低廉、产量高等特点而得以广泛应用。米曲霉是一类产复合酶的菌株,除产蛋白酶外,还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等,米曲霉广泛应用于食品、饲料、生产曲酸、酿酒等发酵工业,并已被安全地应用了1000多年。生物化学实验室己从土壤腐殖层中分离得到产碱性蛋白酶的米曲霉gif-10菌株,经验证在碱性条件下具有很强的降解酪蛋白的能力,本研究拟从米曲霉西f-10中克隆碱性蛋白酶基因并在毕赤酵母中高效表达。将已公布的碱性蛋白酶KerA氨基酸序列与米曲霉RIB40基因组数据库比对,得到碱性蛋白酶基因dp1和alp2。设计引物从米曲霉gif-10基因组中PCR扩增得到alp1和alp2的基因序列并构建到pMD19T载体中。提取米曲霉总RNA,反转录得到cDN-A,用引物扩增得到alp1和alp2的CDS序列并构建到pMD19T载体中,经测序后发现alp1的CDS序列为1212bp,编码403aa,基因序列为1377bp,其中含有4个外显子,alp2的CDS序列为1488bp,编码495aa,基因序列为1610bp,其中含有3个外显子。经半定量分析发现碱性蛋白酶alp1和alp2均属于诱导型表达。碱性蛋白酶alp1和alp2的氨基酸序列经过比对,发现具有41%同一性,alp2羧基端含有一段44个氨基酸的高度a螺旋的未知功能序列。设计引物,扩增得到alp1和alp2缺失信号肽CDS序列,通过EcoRI和NotI酶切后,连接到pPICZαA载体上,分别得到pPICZαA-alpl、pPICZαA-alp2和pPICZαA-△4alp2(缺失C端44aa)毕赤酵母表达载体,表达载体Sacl线性化后电转毕赤酵母X33,通过Zeocin抗性筛选和PCR鉴定后均得到阳性转化子,经过甲醇诱导表达筛选酶活较高的3株酵母工程菌X33-alpl-3,X33-alp2-2和X33-△alp2-2.诱导表达5天后毕赤酵母工程菌X33-alpl-3最高产酶活为36.9U/mL,比活力66.9U/mg,X33-alp2-2最高产酶仅为2.4U/mL,X33一△alp2-2最高产酶40.5U/mL,比活力70.1U/mg。将酵母工程菌X33-alpl-3和X33-△alp2-2经过甲醇诱导表达,粗酶液超滤浓缩后的酶液经SDS-PAGE分析并用于酶学性质的研究。结果表明：重组碱性蛋白酶alp1和alp2分子量约为29kD和32kD,重组碱性蛋白酶alp1的最适反应pH值为10,Δalp2的最适反应pH值为8.5, 重组碱性蛋白酶alp1和△alp2在50℃保存2h其残余酶活分别为83%和63%,alpl和Δalp2酶促反应10min其最适反应温度分别为65℃和60℃,alp1和/kalp2对干酪素和明胶有很强的降解作用,也能降解牛筋粉,对羽毛和天青角蛋白有微弱的降解,CaCl2、CoCl2、MgCl2均能增强重组碱性蛋白酶alp1和Δalp2的酶活性,Zn2SO4、CuSO4、FeSO4能降低重组碱性蛋白酶alp1和Δalp2的酶活性,PMSF完全抑制了alpl和Δalp2的酶活性,EDTA对alp1和Δalp2的酶活性无明显影响。