论文部分内容阅读
目的：抗菌肽在机体防御中起重要作用。目前已经发现包括cathelicidin多种抗菌肽。Cathelicidin是由保守的N末端及可变的C末端组成,蛋白酶切割前体形成。LL-37是人体内唯一的cathelicidin。LL-37由37个氨基酸组成,呈螺旋状,有亲水和疏水部分,具有广谱抗菌活性。LL-37的防御作用包括调节炎症反应,趋化免疫细胞至损伤或感染部位,结合并中和LPS,促进再上皮化及损伤修复。本研究通过建立LTA诱导的巨噬细胞炎症模型,分析炎症时LL-37的变化,探讨LL-37在LTA诱导巨噬细胞炎症中的作用及机制。方法：LTA(2ug/ml)刺激巨噬细胞系RAW264.7和C57BL/6小鼠原代腹腔巨噬细胞,建立炎症的细胞模型。以ELISA及实时定量PCR方法测定炎症因子的表达,以免疫荧光检测LL-37的细胞定位,联合Western blot方法检测LL-37在炎症时的变化,以Western blot检测LL-37对LTA诱导的炎症的作用机制。结果：1.LL-37细胞定位以免疫荧光证实LL-37是否存在于巨噬细胞中及在巨噬细胞中的分布。结果显示LL-37主要分布在细胞质中。2.LTA诱导巨噬细胞炎症反应以不同浓度来源于金黄色葡萄球菌的LTA刺激RAW264.7及原代小鼠腹腔巨噬细胞,通过ELISA检测培养基中TNF-a的水平,确定LTA是否可以诱导巨噬细胞炎症反应及LTA的最佳浓度。在RAW264.7细胞系中,当LTA浓度从0至2ug/mL时,TNF-α浓度由4.56±0.89升高到7.49±1.80ng/L,在小鼠原代腹腔巨噬细胞中,则由5.18±0.91升至11.22±0.88ng/L。但当LTA浓度为5-20ug/mL时能够引起急性细胞坏死,从而导致TNF-α表达降低。结果提示0至2ug/mL的LTA可以诱导巨噬细胞炎症反应,但过高浓度的LTA导致细胞损伤和死亡3.LL-37在LTA诱导的RAW264.7炎症中的表达以免疫荧光及Western blot方法检测在LTA诱导的RAW264.7细胞炎症中LL-37的表达情况。将化学合成的LL-37加入到RAW264.7细胞培养基中以免疫荧光及Western blot检测检测LL-37的摄取效率。本实验分4组：对照组,LL-37干预组,LTA干预组及LTA与LL-37同时干预组。LTA干预组LL-37表达比对照组增加1.33±0.13倍,有统计学意义(p<0.05)。LTA与LL-37同时干预组LL-37表达比对照组增加1.93±0.18倍,有统计学意义(p<0.05)。LTA与LL-37同时干预组中,LL-37的表达较LTA干预组明显升高,有统计学意义(p<0.05),但与LL-37干预组无明显差异(p>0.05)。由此提示LTA可以诱导LL-37的表达,LL-37可以透膜进入RAW264.7细胞。4.LL-37可以减弱由LTA诱导的巨噬细胞炎症反应通过ELISA方法检测是否LL-37可以减弱由LTA诱导的RAW264.7细胞及原代小鼠腹腔巨噬细胞的炎症反应。首先以2ug/mL的LTA诱导RAW264.7细胞及小鼠原代腹腔巨噬细胞产生炎症。随后以0-40ug/mL的LL-37干预。结果显示：在RAW264.7细胞中,1-15ug/mL的LL-37以浓度依赖的方式降低TNF-α的表达,TNF-α浓度由基础值6.46±0.36ng/L降低至4.63±0.81ng/L, LL-37的最适浓度为15ug/mL;而在小鼠原代腹腔巨噬细胞中,1-10ug/mL的LL-37以浓度依赖的方式降低TNF-α的表达,TNF-α浓度由基础值10.52±0.92ng/L降低至6.69±0.64ng/L, LL-37的最适浓度为10ug/mL。结果所示,若LL-37浓度超过最适浓度,则可导致细胞损伤,增加TNF-α释放。因此适当浓度的LL-37可以减弱LTA诱导的巨噬细胞的炎症反应,但是过高浓度则可以导致细胞损伤。本实验以15ug/mL的LL-37干预RAW264.7细胞,以10ug/mLELISA的LL-37干预小鼠原代腹腔巨噬细胞。5.LL-37可以通过降低炎症因子的表达减弱LTA诱导的巨噬细胞炎症反应TNF-α及IL-6是炎症中的主要炎症因子。我们通过实时定量PCR检测RAW264.7细胞中及ELISA检测小鼠原代巨噬细胞培养基中的TNF-α及IL-6表达来证明LL-37是否可以通过降低炎症因子的表达减弱LTA诱导的巨噬细胞炎症反应。结果显示：在RAW264.7细胞中与对照组比较,LTA干预组中,TNF-α及IL-6的mRNA分别增加8.75±0.47倍及34.12±9.68倍；与LTA干预组比较,LTA和LL-37同时干预组TNF-α及IL-6的mRNA明显降低。提示LL-37可以明显降低TNF-α及IL-6的mRNA表达水平。在小鼠原代巨噬细胞中,与对照组比较,LTA干预组中,TNF-α及IL-6的浓度分别由基础值的4.98±1.30ng/L,16.75±9.06ng/L增加至7.53±2.21ng/L,180.38±29.46ng/L;与LTA干预组比较,LTA和LL-37同时干预组TNF-a及IL-6的浓度明显降低。因此LL-37可以通过降低炎症因子TNF-a及IL-6的表达减弱LTA诱导的炎症反应。6.LL-37通过抑制p38MAPK及Akt的磷酸化抑制LTA诱导的巨噬细胞炎症反应通过验证RAW264.7细胞及小鼠原代巨噬细胞中p38MAPK及Akt的磷酸化水平检测LL-37的信号通路。结果显示：LTA通过增加巨噬细胞p38MAPK及Akt的磷酸化水平促进炎症产生；LL-37通过抑制巨噬细胞p38MAPK及Akt的磷酸化水平抑制LTA诱导的巨噬细胞炎症产生。结论：1.在LTA诱导的金黄色葡萄球菌感染的巨噬细胞炎症模型中,TNF-α、IL-6及LL-37表达水平上升,提示LTA可以引起巨噬细胞产生炎症反应,LL-37参与LTA引起的炎症反应。2.LL-37降低炎症因子表达,提示LL-37可以缓解炎症反应。3.LTA可以促进p38及Akt磷酸化,LL-37可以抑制p38及Akt的磷酸化,提示LL-37可以通过抑制p38及Akt磷酸化参与LTA诱导的炎症反应。