氮素的过量排放会导致水体富营养化等破坏生态环境和水资源安全的问题。微生物降解废水中的过量氮素是重要的脱氮方法之一,然而天然的脱氮微生物的降解效率较低、对氧气需求和营养环境要求高,从而限制了脱氮工艺的发展。随着微生物代谢工程和合成生物学等技术的发展,以及对氮素降解机制的理解不断加深,人工改造环境微生物强化脱氮功能成为了可能。从活性污泥中分离的脱氮副球菌（Paracoccus denitrificans）是一种环境友好的α-变形菌纲菌株,属于典型的异养硝化好氧反硝化菌株（Heterotrophic nitrifying and aerobic denitrifying bacteria,HN-AD）,其打破了传统反硝化必须在厌氧条件下进行的界限,在有氧条件下也可进行反硝化过程,具有较好的脱氮能力。基于此,本研究以脱氮副球菌（Paracoccus denitrificans）DYTN-1为底盘细胞,建立了一个基因表达系统,包括一套质粒和一组诱导型启动子,以实现在P.denitrificans DYTN-1中外源基因过表达的目标。使用该表达系统过表达amoA、amoB、hao和nirS基因,P.denitrificans DYTN-1的脱氮能力得到了提高。本研究是首次在P.denitrificans中通过代谢工程策略强化氮素降解的报道,所建立的表达系统和构建的工程菌株为后续更高效的人工脱氮微生物构建和应用提供了基础和参考。具体研究内容如下:（1）以P denitrificans DYTN-1为底盘的代谢工程改造可行性研究。P.denitrificans DYTN-1是从自然界中筛选出的天然菌株,是否可对其进行代谢工程改造尚未可知。因此,首先通过抗生素耐受试验和生长条件的摸索,确定了接合转化的条件,随后通过α-变形杆菌接合pIND4质粒,发现P.denitrificans DYTN-1可成功接受供体菌所携带质粒,阳性率是70%。在随后传代培养中,质粒pIND4表现出了较高的稳定性,说明P.denitrificans DYTN-1作为底盘细胞进行遗传改造是可行的。（2）建立P.denitrificans DYTN-1中遗传稳定的质粒表达系统。质粒作为遗传表达的关键工具,获得可以自主复制并在细胞中保持恒定拷贝数的复制起点,对在P.denitrificans DYTN-1中建立遗传稳定的质粒表达系统具有重要意义。然而,目前尚无P.denitrificans复制起点的研究报道,为了克服这一挑战,我们构建了一套可在P.denitrificans DYTN-1中遗传表达的质粒。质粒含有不同的复制起点和抗生素筛选标记,并表现出高度遗传稳定性和梯度拷贝数。其中,复制起点的梯度拷贝数为后续调节基因表达水平提供了基础。同时,也为实现多个质粒在同一菌株中的应用奠定了基础。（3）P.denitrificans DYTN-1来源的氮素诱导型内源启动子筛选与表征。作为代谢工程的调控元件,启动子具有调节基因表达的关键作用。为了了解氮素降解相关代谢途径和功能,挖掘受氮素诱导的启动子用于后续代谢工程调控,本研究基于P.denitrificans DYTN-1基因组学分析,研究氮代谢相关基因,成功筛选到受无机氮源诱导的内源性启动子且呈梯度诱导趋势,产生2～35倍的表达差异。与有机氮源相比,16个受亚硝酸盐诱导的启动子的响应倍数均匀分布在2到7倍之间。另外,在21个由硝酸盐和铵盐同时诱导的启动子中,P1690和Pnir启动子在1 g·L-1铵盐和2 g·L-1硝酸盐诱导时表达差异最高,分别产生35倍和27倍诱导。同时,针对P0893、P1746、P1845、P1851、P4130和Prpsu 6种强诱导型启动子,研究了不同氮源对启动子的诱导特性,发现内源诱导型启动子具有通过感应氮素浓度变化来动态调节脱氮基因表达的潜力。因此,筛选响应这些无机盐的启动子对于优化脱氮相关基因的表达至关重要,也为设计和构建复杂的动态脱氮途径提供了工具。（4）代谢工程强化P.denitrificans DYTN-1降解氮素污染。以构建的P.denitrificans DYTN-1质粒表达系统为基础,运用铵盐诱导型启动子调控硝化过程关键基因amoA、amoB和hao,硝酸盐诱导型启动子调控反硝化过程限速酶基因nirS,成功提高了脱氮能力。其中nirS过表达的菌株在处理24 h后培养基中NO3-的残余量为野生型菌株的67%。此外,同时过表达hao和nirS基因进一步增强了氮素降解,在处理12 h后,其NO3-的剩余量仅为野生菌株的50%,且最终总氮的降解效率达79.5%,提高了32.3%。因此,通过过表达硝化和反硝化途径关键酶,成功达到代谢工程强化P.denitrificans DYTN-1降解氮素污染的目的。