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端粒是真核生物染色体末端的天然结构,由特殊的端粒DNA及包裹在其上的蛋白复合体“Shelterin”组成。这一蛋白复合体由Pot1、TPP1、Tin2、TRF1、TRF2和RPA1六种端粒蛋白因子通过相互之间的蛋白质相互作用网络形成,并通过Pot1与端粒单链DNA,以及TRF1和TRF2与端粒DNA双链区的直接结合锚定在染色体末端。端粒蛋白质-DNA功能复合体不稳定会在染色体末端引起DNA损伤反应,导致细胞衰老、凋亡、染色体末端融合和基因组不稳定性等严重细胞生物学后果。因此端粒结构和功能状态调控在细胞生命活动中具有特殊重要意义。Pot1是目前已知的Shelterin复合物中唯一和端粒3’单链DNA结合的组分。研究表明Pot1在端粒保护功能上主要是发挥一种抑制染色体末端DNA损伤反应活化的功能,抑制Pot1的表达会造成一种依赖于ATR的染色体末端损伤。但Pot1的这种端粒保护功能是如何发挥的现在还不清楚。因此本论文就Pot1在人肿瘤和正常细胞中发挥染色体末端保护作用的结构基础及功能意义开展了以下内容的研究:一、Pot1在肿瘤及正常细胞染色体末端保护中的作用为探讨Pot1抑制ATR的端粒保护功能是否在肿瘤和正常细胞染色体末端保护中有不同意义,我们首先分析了RNAi抑制Pot1表达在肿瘤和正常细胞诱导端粒DNA损伤反应的信号途径。结果发现无论是在正常细胞还是在肿瘤细胞中Pot1都发挥同样的抑制ATR的端粒保护功能。接下来我们利用一个缺失了N-端OB-结构域的Pot1缺失突变体确定了Pot1的端粒单链DNA结合能力在肿瘤细胞中对于Pot1的端粒定位以及端粒保护结构功能的发挥都不是必需的,而在正常细胞中Pot1发挥其保护端粒功能则依赖于其与端粒单链DNA结合能力。这一结果揭示Pot1在肿瘤和正常细胞中虽然发挥同样的端粒保护功能,但在结构和功能关系上发生了本质的变化。TPP1是目前已知的一个与Pot1在胞内组成型相互作用的端粒蛋白。在肿瘤细胞中Pot1-TPP1相互作用具有介导Pot1入核和端粒定位的功能,并负责在端粒末端募集端粒酶并正、负调控端粒酶延长端粒DNA,维持端粒长度内稳态。但Pot1-TPP1在正常人体细胞端粒生物学上的功能意义目前并不清楚。因此我们对Pot1-TPP1相互作用在肿瘤和正常细胞端粒生物学功能意义进行系统性比较研究。首先我们通过酵母双杂交和免疫共沉淀等方法确定了Pot1与TPP1相互作用的最小片段（命名为Pot1-C3）,然后我们又用置换突变的方法找到了Pot1与TPP1相互作用的关键性氨基酸残基位于Pot1486-491aa。在确定了Pot1与TPP1相互作用的结构基础后我们又对Pot1/TPP1相互作用在肿瘤和正常细胞中介导Pot1入核及在Pot1端粒保护功能中的意义进行了研究。我们构建了丧失TPP1结合能力的Pot1全长点突变体Pot1M,然后分别将其在肿瘤和正常细胞中高表达,结果发现无论在肿瘤还是正常细胞中Pot1M均不能入核,也不能替代内源性的Pot1起到抑制ATR保护端粒的作用。这些结果说明Pot1/TPP1相互作用介导Pot1入核,在肿瘤和正常细胞中都是起到调控Pot1功能的关键性限制步骤。为了考察Pot1入核后端粒保护功能的发挥是否依然受TPP1的控制,我们将Pot1M前加上入核序列（Pot1MN）,然后再将其在肿瘤和正常细胞中高表达,结果发现在肿瘤细胞中Pot 1MN虽然能有效入核,但其依然不能端粒定位,也不能行使其端粒保护功能,而在正常细胞中Pot 1MN则表现出同野生型Pot1几乎完全相同的端粒定位及端粒保护能力。这一重要发现表明Pot1在进入细胞核后的端粒定位调控机制在肿瘤和正常细胞中发生了显著变化。二、靶向Pot1与TPP1核内相互作用在广谱特异性抗肿瘤治疗应用中的意义。我们在第一部分研究中揭示出Pot1的染色体端粒保护作用在肿瘤和正常细胞间存在显著不同的结构-功能效应机制。在本部分的研究中,我们主要利用前文鉴定出的一个Pot1与TPP1相互作用的最小片段Pot1-C3,探讨特异性阻断Pot1-TPP1在细胞核内的相互作用能否成为一条广谱特异性抗肿瘤治疗新途径。通过免疫共沉淀实验我们发现Pot1-C3结构域片段高表达具有竞争性抑制Pot1和TPP1相互作用的生物学活性,且这种抑制可以改变端粒酶阳性肿瘤细胞中Pot1的端粒定位,却不影响正常细胞中的Pot1定位。而且高表达Pot1-C3还会造成端粒酶阳性的肿瘤细胞出现ATR依赖的端粒损伤,但对端粒酶阴性的肿瘤细胞及正常细胞没有影响。至此,我们证明了利用Pot1-C3阻断Pot1-TPP1胞内相互作用是特异性诱导端粒酶阳性肿瘤细胞急性端粒DNA损伤反应。为进一步探讨阻断Pot1-TPP1相互作用能否成为一条广谱特异抗肿瘤治疗新途径,首先我们选用6种不同组织来源的人端粒酶阳性的肿瘤细胞株,分别感染Adv-Pot1-C3,同时以空载体腺病毒为对照,结果发现Adv-Pot1-C3可以造成这些细胞株发生快速的生长抑制,随后通过Hoechst染色以及Western Blot检测凋亡标志分子PARP的降解情况发现这种生长抑制是由于Adv-Pot1-C3造成端粒酶阳性的肿瘤细胞凋亡引起的。而用Adv-Pot1-C3感染端粒酶阴性的肿瘤细胞U2OS以及4种正常的人二倍体成纤维细胞都没有出现生长抑制,Hoechst染色以及Western Blot检测也没有凋亡的出现,这说明Adv-Pot1-C3是特异性抑制端粒酶阳性的肿瘤细胞的生长而对正常细胞的生长没有影响,这也提示我们Adv-Pot1-C3用于抗肿瘤治疗具有一定的安全性。在完成Adv-Pot1-C3体外抗肿瘤药效学研究后,我们又对Adv-Pot1-C3的体内抗肿瘤效果进行评测。我们选用Hela（人宫颈癌）、SMMC7721（人肝癌）、HepG2（人肝癌）以及BEL7402（人肝癌）这四种具代表性的端粒酶阳性肿瘤细胞建立肿瘤细胞移植性裸鼠荷瘤模型,然后将腺病毒Pot1-C3多点注射瘤体内部及瘤体周围进行治疗,然后处死裸鼠取出肿瘤。结果与对照组空载体病毒相比,Adv-Pot1-C3对四种荷瘤裸鼠体内肿瘤的生长都有非常显著的抑制作用,总体有效性在80%以上。通过Adv-Pot1-C3直接注射到瘤体内会对裸鼠体内生长的肿瘤具有明显的抑制作用后,我们又考察了不同给药途径对肿瘤生长的影响,结果发现无论是瘤体局部给药还是腹腔系统性给药Adv-Pot1-C3均有抑制肿瘤生长的效果,只是由于病毒没有靶向性的标志物,所以系统性给药效果稍差。通过以上Adv-Pot1-C3体内外抗肿瘤的药效学实验的结果,我们看到Adv-Pot1-C3可以非常显著地抑制体内外端粒酶阳性肿瘤细胞的生长,而且具备一定的安全性。总结:一、本论文揭示了Pot1端粒定位及端粒保护功能的调控机制在肿瘤和正常细胞中存在显著差异。二、靶向Pot1-TPP1的胞内相互作用可作为抗肿瘤治疗的一条新途径。