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小麦赤霉病是我国小麦上最重要的病害之一。目前在植物病害综合防治体系中,使用苯并咪唑类杀菌剂(如多菌灵)是防治这种病害最常用、最有效的措施。但据近几年的监测发现,病原菌对该类杀菌剂的抗性群体发展迅速。据本实验室研究,小麦赤霉病对多菌灵(MBC)的抗性主要是由于禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum.Retch)的β2-微管蛋白基因突变引起的,该蛋白第167位、198位、200位等氨基酸的突变都会引起不同水平的抗性,本文利用原核表达技术构建了β2-微管蛋白不同突变位点基因的表达载体,并制备了野生型菌株β2-微管蛋白的单克隆抗体。为研究其抗性产生的原理和蛋白质与药物的互作奠定了基础。本文分别扩增了禾谷镰孢菌对多菌灵敏感菌株(MBCS)的p1-微管蛋白基因(p-S)和β2-微管蛋白基因(p2-S),及对多菌灵中抗菌株(MBCMR)和高抗菌株(MBCHR)的β2-微管蛋白基因(β2-MR和β2-HR),测序后构建了原核表达载体β1-S/pET28a, β2-S/pET28a,β2-MR/pET28a, β2-HR/pET28a,转化至大肠杆菌Rosetta (DE3)pLysS。经IPTG (1mM)诱导后,得到了C末端融合6×His纯化标签的表达产物,产物SDS-PAGE电泳分析和Western blot验证,表明在大肠杆菌中表达了分子量约50kD的蛋白,和预测蛋白大小一致,并且表达的蛋白能与抗His标签的单抗发生特异性反应。在原核表达系统,由于构建的表达载体能够进行高效表达,使得表达的目标蛋白浓度太高而形成包涵体,亦或在原核表达系统中缺少真核表达系统中的修饰体系,而形成包涵体。包涵体蛋白是没有生物活性的蛋白,必须经过溶解、复性和纯化才能进一步使用,本文以MBCs菌株β2-微管蛋白(β2-S)为例,优化了包涵体洗涤条件,比较了两种复性方法(直接透析复性和稀释后透析复性)和三种纯化方法(His-TrapHβ预装柱纯化法、离子交换纯化法、PD-10重力柱纯化法),最终选用含3M尿素的洗涤液进行包涵体的洗涤,用先稀释后复性的方法进行包涵体复性,用PD-10重力柱纯化法纯化目标蛋白。将复性纯化后的β2-S作为抗原,常规免疫小鼠,4周后当小鼠血清效价达到1：6500时进行融合,待观察到杂交瘤细胞后,以纯化的β2-S包被酶标板,进行反复间接ELISA检测后,得到3株杂交瘤细胞株H1、H2、H3,分别进行单克隆,得到相对应的单克隆细胞株4株(MAb1-1、MAb1-2、MAb2-1、MAb3-1)。用复性纯化β2-S的方法分别复性纯化β1-S、β2-MR、β2-HR微管蛋白,并以它们为材料,采用Western blot和ELISA方法,检测制备的单克隆抗体特异性。实验中发现,4种单克隆抗体都能与纯化的β2-S、β2-HR蛋白有反应,而对纯化的β1-S、β2-MR蛋白没有反应,证明4种单克隆抗体均可以区分出β2-S和β1-S、β2-MR蛋白。