猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)的病原是猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)。该病在临床上主要引起母猪流产、死胎或木乃伊胎,并引起育肥猪和仔猪的呼吸障碍。1987年,美国首先报道该病,1996年我国首次分离并报道该病。PRRSV为单股正链(+)RNA病毒,归类于动脉炎病毒科,动脉炎病毒属。2006年5月,高致病性PRRS(HP-PRRS)从我国南方地区开始爆发,主要表现为发病猪群的“三高”,即体温高、发病率高、死亡率高,HP-PRRS的爆发导致我国养猪业损失巨大。许多研究表明,PRRSV变异毒株对中枢及外周免疫器官的噬性显著增强,除能引起胸腺严重萎缩外,还能导致外周免疫器的出血、坏死、淋巴细胞严重减少并伴随细胞凋亡现象。目前,PRRS/HP-PRRS的防控仍然是兽医病毒学及免疫学界的难题,感染宿主对PRRSV/HP-PRRSV的免疫应答仍不清楚。PRRSV/HP-PRRSV感染猪抗体产生较早且抗体滴度较高,但早期产生的抗体难以保护机体免受病毒的感染,甚至发挥抗体依赖性增强作用帮助病毒对机体造成更严重的伤害。本课题在前期研究的基础上,进一步研究HP-PRRSV感染诱导仔猪胸腺内自噬与凋亡情况,探讨HP-PRRSV对仔猪胸腺的损伤机制;研究PRRSV经典及变异毒株弱毒疫苗抗HP-PRRSV的作用机理;通过使用PRRSV GP5的抗独特型抗体调控机体的免疫网络,研究PRRSV感染与机体免疫网络的关系;探索PRRSV单克隆抗独特型单链抗体的免疫生物学功能。为进一步研究机体对PRRSV的免疫反应机制及免疫调控机制奠定基础。1、PRRSV感染引起胸腺内细胞的自噬和凋亡的研究细胞死亡是被周密调控的一系列复杂过程。凋亡,是一种程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD)方式,用于维持机体自身平衡和内环境稳定,该过程受基因严格调控。自噬,也是程序性细胞死亡的一种方式,它是将受损的细胞器及大分子物质依赖溶酶体降解供机体重新利用的过程。很多疾病的发生及发展过程中,细胞凋亡与细胞自噬并存,它们在调控细胞死亡的过程中通路相互关联,互为调控。胸腺作为哺乳动物的中枢免疫器官之一,既介导细胞免疫,又为T细胞分化、发育提供场所。PRRSV感染可造成体内及体外培养细胞的凋亡及体外感染细胞的自噬现象,然而,HP-PRRSV感染引起仔猪胸腺萎缩,在萎缩的胸腺内细胞自噬情况未见相关报道。本实验目的是通过流式细胞技术、Western blot技术,研究HP-PRRSV感染仔猪胸腺诱导胸腺细胞的自噬与凋亡情况;通过免疫荧光共聚焦技术,阐明HP-PRRSV感染仔猪胸腺内病毒感染细胞、凋亡细胞与自噬细胞的关系,鉴定发生自噬细胞的类型。实验结果显示:HP-PRRSV感染仔猪的胸腺内,既存在细胞自噬现象,也存在细胞凋亡现象;自噬既可发生于病毒感染的细胞,也发生于病毒未感染细胞;发生自噬的细胞为CD14+细胞及胸腺上皮细胞,而占有胸腺中细胞总数85-90%的T细胞没有发生自噬,而发生了凋亡。2、PRRSV不同毒株弱毒疫苗对HP-PRRSV免疫保护作用的研究自2006年HP-PRRS在我国爆发以来,PRRSV疫苗在猪场中普遍使用。然而,由于PRRSV的免疫机制目前尚不清晰,PRRSV疫苗的选择及使用尚存在很大的争议。目前临床上流行的毒株以变异毒株为主,但经典PRRSV弱毒疫苗在使用中安全性较高,并对HP-PRRSV有交叉保护性,在临床上也被广泛使用。因此,本实验选用PRRSV经典株弱毒疫苗CH-1R株及变异毒株弱毒疫苗Hu N4-F112毒株免疫断奶仔猪,使用变异毒株HP-PRRSV Hu N4攻毒后,通过观察临床症状、病理组织学变化,检测血清中病毒载量、细胞免疫及体液免疫的变化,探讨不同毒株弱毒疫苗对变异毒株的免疫保护作用。实验结果显示:CH-1R、Hu N4 F112免疫的仔猪均有效的抵御HP-PRRSV的感染,二者在临床症状、眼观剖检变化、肺脏及胸腺的病理变化都明显优于HP-PRRSV攻毒组。然而,同Hu N4 F112免疫组相比,CH-1R组在疫苗免疫期膜蛋白抗体水平及HP-PRRSV感染后血清病毒载量都存在明显差异。PRRSV诱导机体产生的中和抗体主要是以膜蛋白抗体为主,Hu N4 F112免疫猪血清中的中和抗体在体外能有效阻止HP-PRRSV感染Marc-145细胞。本研究中,CH-1R免疫组与Hu N4 F112感染组在攻毒后血清病毒载量差异是否与同源毒株产生的中和抗体有关需进一步研究。3、PRRSV GP5抗独特型抗体影响PRRSV弱毒疫苗的使用效果我们前期研究发现,感染了PRRSV的猪体内可产生两种不同的针对GP5的抗独特型抗体,这两种抗独特型抗体可影响PRRSV感染猪的带毒状态。本实验目的是使用PRRSV GP5抗独特型抗体对机体进行免疫调控,观察抗独特型抗体对PRRSV弱毒疫苗的使用效果。实验猪群分别接种PRRSV GP5单克隆抗独特型抗体Mab2-5G2及自身抗独特型抗体,然后用CH-1R弱毒苗连续免疫两次,最后HP-PRRSV攻毒,每次操作时间间隔是14天。检测指标包括:观察临床症状、胸腺及肺的病理变化、血清中的病毒含量、细胞因子IFN-γ、IL-2/4/10及血清抗PRRSV特异性抗体和中和抗体水平,探讨PRRSV抗独特型抗体对CH-1R弱毒苗的调控效果。实验结果显示,PRRSV抗独特型抗体降低了PRRSV弱毒苗的使用效果,诱导机体在病毒感染之前产生较高水平的IL-4及较低水平的中和抗体。该猪群与同型对照猪群相比,病毒感染后体温较高且持续时间长,感染早期血清病毒含量较高。以上实验结果表明,当机体PRRSV抗独特型抗体存在时,频率较高地进行疫苗的接种可能对猪群带来一定的风险性。4、PRRSV单克隆抗独特型单链抗体免疫学特性研究MAb2-5G2是PRRSV GP5的抗独特型抗体,即“内影像”分子,能有模拟抗原表位而诱导机体的免疫反应,应用价值有待开发;而单链抗独特型抗体分子量小、没有毒性且易于穿入组织细胞又容易在大肠杆菌中大量表达,较抗独特型抗体优势明显。我们前期的研究表明经过复性后的原核表达MAb2-5G2 sc Fv具备MAb2-5G2的生物学功能,对MAb2-5G2 sc Fv的免疫学功能的研究发现:分别用MAb2-5G2v、sc Fv连续免疫兔子制备的抗血清能够与彼此的抗原发生交叉反应且二者的抗血清能够抑制HP-PRRSV感染Marc-145细胞。本实验进一步研究MAb2-5G2sc Fv的免疫学特性,使用MAb2-5G2及其sc Fv接种实验仔猪,结合PRRSV弱毒疫苗的使用,观察二者对弱毒疫苗使用效果的影响。实验猪群首先免疫接种PRRSV GP5单克隆抗独特型抗体Mab2-5G2或Mab2-5G2Sc Fv,然后接种一次CH-1R弱毒苗,最后接种HP-PRRSV,观察临床症状、胸腺及肺的病理组织学变化、检测病毒感染后血清病毒载量及血清抗PRRSV膜蛋白抗体水平。实验结果显示,MAb2-5G2 sc Fv保留了Mab2-5G2模拟GP5抗原的免疫学特性,二者在病毒感染后均较快地诱导机体产生了针对PRRSV膜蛋白的抗体,提高了HP-PRRSV感染仔猪的的成活率。