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研究目的:糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病(diabetes mellitus,DM)的常见并发症,是一种微血管病变,亦是DM患者致盲的主要原因之一,研究DR发病机制对预防和治疗糖尿病视网膜病变具有极其重要的意义。本课题通过检测GSK-3β抑制剂对糖尿病大鼠视网膜病变自噬相关蛋白表达变化,探讨其调控机制,为糖尿病视网膜病变的治疗提供理论基础。研究方法:1.动物实验1.1 1型DM大鼠模型建立体重180-200g的雄性健康SD大鼠80只,适应性喂养1周后,按体重均衡的原则随机分为正常对照组(Control组,20只)、模型组(DM组,60只)。对模型组一次性腹腔注射1%链脲佐菌素(STZ,60 mg/kg,pH=4.4柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液)造模,注射前禁食16h,不禁水。对照组大鼠注射同体积柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液。72h后尾静脉采血,血糖试纸检测空腹血糖值(fasting blood glucose,FBG),以FBG≥11.1mmol/L,认为1型糖尿病大鼠模型成功。1.21型DM大鼠糖尿病视网膜病变以及自噬相关蛋白表达的变化研究造模成功大鼠按体重及血糖均衡原则随机分为4 wk模型组、8 wk模型组及4 wk甲异靛给药组和8 wk甲异靛给药组,每组15只。对照组分为4 wk对照组以及8 wk对照组,每组10只。分组完成后继续以普通饲料喂养,并对给药组每天灌胃甲异靛,按大鼠体重每100g给药1 mg。分别在给药4周及8周末对大鼠麻醉,腹主动脉取血,离心分离血清,ELISA检测各组大鼠血管内皮生长因子(VEGF)、大鼠低氧诱导因子-1α(HIF-1α)。取出眼球,清理干净眼球周边的肌肉组织,分离出视网膜,采用免疫组织化学法(immunohistochemical,IHC)检测各组大鼠视网膜GSK-3β、VEGF、LC3A/B、ATG5的表达变化,Western blotting(WB)检测各组大鼠视网膜内GSK-3β、LC3A/B、ATG5蛋白表达变化。2.细胞实验2.1.细胞培养及甲异靛对RMEC细胞增殖的影响取生长状态良好的RMEC,用0.25%胰蛋白消化酶制成单细胞悬液,调整细胞数为1×105·mL-1,接种于96孔板,每孔100μL,接种后放于CO2培养箱中培养。当细胞生长至70%-90%融合时,加入不同浓度梯度甲异靛培养24h后,检测不同浓度甲异靛对大鼠RMEC细胞增殖的影响,确定甲异靛最适浓度。2.2 RMEC细胞高糖模型建立将对数期生长状态良好的RMEC细胞,用0.25%胰蛋白消化酶制成单细胞悬液,调整细胞数为1×105·mL-1,接种于6孔板,分为正常对照组、高糖(HG,33 mmol/L)组、高糖+甲异靛组(47μmol/L),作用48h。2.2.高糖培养RMEC细胞及GSK-3β蛋白以及自噬相关蛋白表达变化研究采用Western blotting(WB)检测各组GSK-3β、LC3A/B、ATG5蛋白表达的变化。实验结果:1.糖尿病大鼠一般状况与对照组比较,DM组大鼠逐渐出现精神萎靡,腥臊臭味加重和多饮、多食、多尿、体重降低等糖尿病症状。实验造模成功大鼠60只,分成DM组以及甲异靛给药组。DM组以及甲异靛给药组大鼠FBG明显升高。4wk DM组大鼠视网膜发生病变,且视网膜新生血管增多,视力下降,随着糖尿病病程的进展,8 wk DM组大鼠视网膜血管明显增多,角膜模糊,屈光质模糊出现异常;与DM组大鼠相比较给药组大鼠视网膜新生血管明显减少,视网膜病变减轻。DM组大鼠血清中VEGF、HIF-1α明显升高,与模型组大鼠比较给药组大鼠VEGF、HIF-1α有降低趋势。2.DM组大鼠以及给药组大鼠视网膜内GSK-3β蛋白及自噬相关蛋白表达变化WB结果表明,与对照组大鼠比较,4wkDM组大鼠以及8wkDM组视网膜中GSK-3β表达明显升高(P<0.05),自噬蛋白ATG5、LC3A/B表达明显增加(P<0.05)。与4wk DM组大鼠比较,8wk DM组大鼠蛋白表达持续升高。与DM组大鼠比较,4wk给药组以及8wk给药组大鼠GSK-3β表达明显降低,自噬蛋白ATG5、LC3A/B表达减少(P<0.05)。3.高糖培养RMEC细胞GSK-3β蛋白及自噬相关蛋白表达变化MTT检测结果显示,甲异靛在高浓度时明显抑制细胞生长,并显示一定的细胞毒性,确定甲异靛最适浓度47μmol/L。细胞增殖率实验显示,与对照组相比较,高糖培养组细胞增殖率明显提高(P<0.05);但与高糖组相比,甲异靛给药组细胞增殖率无明显变化(P>0.05)。WB结果表明,与对照组相比,高糖组RMEC细胞GSK-3β蛋白及自噬相关蛋白表达明显增高。与高糖组相比,给药组GSK-3β蛋白及自噬蛋白ATG5、LC3A/B表达减少(P<0.05)。结论:1.STZ诱导的大鼠DM成模后,随着糖尿病的发生发展,大鼠视网膜明显发生病变,视网膜新生血管明显增多,且大鼠视力逐渐下降;与DM组大鼠相比较,甲异靛给药组大鼠视网膜病变明显有减轻趋势,视网膜内新生血管明显减少。2.在4wkDM以及8wkDM大鼠视网膜中,GSK-3β表达升高,且VEGF、ATG5以及LC3A/B蛋白含量明显增加,自噬水平升高。而在4wk给药组以及8wk给药组中,在GSK-3β表达降低的同时,VEGF、ATG5以及LC3A/B蛋白表达也相应减少,自噬水平降低。表明GSK-3β及自噬参与糖尿病视网膜病变的发生发展,通过甲异靛给药抑制GSK-3β的表达,影响自噬相关蛋白在视网膜内的表达,参与糖尿病视网膜病变的发生发展,对视网膜起到一定的保护作用。3.高糖培养的RMEC细胞,通过抑制GSK-3β的表达,可以使自噬蛋白ATG5、LC3A/B表达降低,自噬水平降低。表明抑制GSK-3β,可以调节自噬的变化,参与糖尿病视网膜病变的发生发展,GSK-3β抑制剂可作为治疗糖尿病视网膜病变的靶点进行深入研究。