论文部分内容阅读
大豆的抗倒伏和种子相关性状是大豆重要的农艺性状，其中抗倒伏性状与茎杆机械结构以及组成成分息息相关。现代栽培大豆(Glycine maxL. Merr.)是由一年生野生大豆(Glycine sojaSieb)驯化而来。与栽培大豆茎杆粗壮、直立的生长特征不同，野生大豆生长习性中一个重要的特征是茎杆细弱、呈现匍匐生长状态；另外，其粒重和种子油份含量等也呈现较大差异。为了解析这些差异背后的控制基因，更好地理解大豆驯化的过程，我们利用野生大豆(ZYD00463)和栽培大豆(WDD01514)构建了重组自交系(RILs)群体，并利用SLAF-seq测序技术开发SNP标记，构建了大豆的高密度遗传图谱。在对亲本茎杆的解剖结构进行分析后，我们对大豆茎杆化学成分、籽粒油份、粒重和粒形等相关性状进行QTL定位分析，并结合RNA-seq分析，鉴定了可能的候选基因，以期为进一步基因的功能验证和机理解析打下基础。本研究主要结果如下：
1.组织层面上，栽培大豆茎杆中维管组织较为发达，特别是木质部、厚壁组织(木质部纤维和导管壁)；野生大豆的厚角组织(皮层厚角组织)、表皮、薄壁组织(皮层、韧皮部、木质部和髓薄壁组织)、厚壁组织(韧皮部纤维)更为发达。此外，野生大豆中与导管相关的参数，如D、VS、Fpf、VI均小于栽培大豆；野生大豆中VG和(t/bh)2值和小导管比例大于栽培大豆。细胞水平上，栽培大豆茎杆次生壁的厚度大于野生大豆。分子水平上，栽培大豆茎杆中木质素、纤维素和半纤维素含量较高，野生大豆中果胶含量较高。另外，甘露聚糖和甲酯化果胶在茎杆中的分布也存在明显差异，野生大豆的韧皮纤维细胞壁中未检测到甘露聚糖，栽培大豆的果胶甲基酯化程度明显低于野生大豆，这些差异可能是大豆茎杆适应驯化的结果。我们推测栽培大豆茎杆机械强度更强，而野生大豆对环境胁迫的抗性更高。
2.利用SLAF-seq测序技术在亲本和子代中开发了11,398个SNP标记，并构建了覆盖2913.78cM的高密度遗传连锁图，平均遗传距离是0.26cM。木质素和纤维素含量在单个环境中的遗传力较高，多个环境中的遗传力较低，它们的遗传受环境影响较大。一年两点环境下鉴定出8个与木质素含量相关的QTL，如qLC1-1、qLC6-1、qLC11-1、qLC12-1、qLC12-2、qLC12-3、qLC13-1和qLC14-1；另外鉴定出8个与纤维素含量相关的QTL，如qCC1-1、qCC1-2、qCC18-1、qCC19-1、qCC5-1、qCC5-2、qCC9-1和qCC19-2。这些QTL位点仅仅在单个环境中被检测到，多个环境中并没有检测到稳定的QTL。
3.方差分析显示，两年两点环境中籽粒油份和脂肪酸含量的广义遗传力较高。共定位到24个稳定的QTL，其中7个与油份含量相关，如qOC2_1、qOC8_1、qOC8_2、qOC15_1、qOC15_2、qOC20_1和qOC20_2；4个与棕榈酸有关，如qPA10_1、qPA13_1、qPA15_1和qPA16_1；3个与硬脂酸有关，如qSA14_1、qSA14_2和qSA14_3；2个与油酸相关，如qOA11_1和qOA15_1；4个与亚油酸有关，如qLA5_1、qLA5_2、qLA11_1和qLA11_2；4个与亚麻酸相关，如qLNA5_1、qLNA14_1、qLNA15_1和qLNA15_2。其中qPA10_1为新的QTL位点，目前未见报道。这些稳定的QTL中有16个是主效QTL，如qOC15_1、qOC15_2、qOC20_1、qOC20_2、qPA10_1、qSA14_1、qSA14_2、qSA14_3、qOA11_1、qOA15_1、qLA11_1、qLA11_2、qLNA5_1、qLNA14_1、qLNA15_1和qLNA15_2。在15号染色体2.37Mb-5.63Mb的遗传区间内检测到6个QTL，如qOC15_1、qOC15_2、qPA15_1、qOA15_1、qLNA15_1和qLNA15_2，该区间看作是油份和脂肪酸遗传的热点区域。从这些稳定的QTL区间内筛选到96个酶基因和250个转录因子基因可能参与脂质代谢。
4.方差分析显示，除了粒长粒宽比(LW)和粒宽粒厚比(WH)外，三年两点环境中粒重和粒形的广义遗传力较高。共鉴定到24个稳定的QTL，其中5个与粒长相关，如qSL4_1、qSL8_1、qSL12_1、qSL19_1和qSL19_2；3个与粒宽相关，如qSW5_1、qSW7_1和qSW19_1；4个与粒厚相关，如qSH5_1、qSH7_1、qSH15_1和qSH19_1；4个与粒长粒宽比相关，如qLW2_1、qLW2_2、qLW5_1和qLW19_1；3个与粒长粒厚比相关，如qLH2_1、qLH2_2和qLH2_3；1个QTLqWH5_1与粒宽粒厚比相关；4个与百粒重相关，如qHGW4_1、qHGW19_1、qHGW19_2和qHGW19_3。这些稳定的QTL中有11个之前未见报道，可能是新的QTL位点，分别是qSL8_1、qSL12_1、qSH15_1、qLW2_1、qLW2_2、qLW5_1、qLW19_1、qLH2_1、qLH2_2、qLH2_3和qWH5_1。这些稳定的QTL中有11个是主效QTL，如qSL19_1、qSL19_2、qSW19_1、qSH19_1、qLW2_1、qLW2_2、qLW5_1、qLH2_2、qLH2_3、qWH5_1和qHGW19_3。在19号染色体39.42Mb-44.99Mb的遗传区间内检测到7个QTL，分别是qSL19_1、qSL19_2、qSW19_1、qSH19_1、qHGW19_1、qHGW19_2和qHGW19_3，该区间看作是粒重和粒形遗传的热点区域。从这些稳定的QTL区间内筛选出136个蛋白基因和240个转录因子基因可能参与籽粒大小的调控。
5.通过对亲本及其两个极端子代在两个发育时期的样品进行RNA-seq测序，共获得180.49Gb的原始数据，Q30的碱基百分比在93.06%及以上，比对效率在92.18%-96.40%之间。错误发现率FDR＜0.01且差异倍数FC≥2(│Log2(FC)│≥1)作为差异表达基因(DEGs)筛选的标准，共获得14,698个DEGs，其中2,217是新基因。通过DEGs的GO和KEGG富集，筛选到一些跟脂质代谢相关的生物学过程，如脂质代谢调控、酰基甘油代谢、油体生物合成和辅酶代谢等。与籽粒大小相关的生物学过程主要是转录水平和转录后水平调控、激素信号途径、泛素蛋白酶途径和细胞增殖与生长调控等。另外一些与碳代谢相关的途径也得到富集，如碳固定、光合作用、丙酮酸代谢、糖酵解/糖异生等。本文共获得121个和189个候选基因分别与脂质代谢和籽粒大小相关，其中有15个DEGs位于籽粒油份和脂肪酸QTL区间内，14个DEGs位于粒重和粒形QTL区间。另外，权重基因共表达网络分析(WGCNA)共鉴定出6个模块与性状相关联，分别从模块和网络图中筛选到69个和76个候选基因，其中有26个基因位于本研究定位的QTL区间内。
6.通过qRT-PCR对16个候选基因或转录因子基因进行定量分析，其中8个基因可能参与脂质代谢和籽粒大小的调控。例如Glyma.06g068800和Glyma.09g098300基因分别编码ERF和bHLH转录因子。Glyma.10g119900和Glyma.13g287600基因分别编码甘油-3-磷酸酰基转移酶6(GPAT6 )和赤霉素2-氧化酶8(GA2OX8 )。Glyma.14g184900基因功能未知，但位于qLNA14_1区间内。Glyma.17g154500基因可能编码胞内富亮氨酸Ras相关蛋白。这6个基因在籽粒中均有表达，并且栽培大豆中的表达量高于野生大豆，同时其表达量与油份和粒重均呈显著正相关。另外Glyma.07g037700基因编码MYB转录因子，在籽粒中特异表达，该基因位于qSW7_1和qSH7_1区间内，表达量与油份和粒重均呈显著正相关。Glyma.09g111900基因编码脂肪酸去饱和酶(FAD2)，在籽粒和花中特异性表达，其表达量与亚油酸含量显著正相关，与油酸含量显著负相关。
1.组织层面上，栽培大豆茎杆中维管组织较为发达，特别是木质部、厚壁组织(木质部纤维和导管壁)；野生大豆的厚角组织(皮层厚角组织)、表皮、薄壁组织(皮层、韧皮部、木质部和髓薄壁组织)、厚壁组织(韧皮部纤维)更为发达。此外，野生大豆中与导管相关的参数，如D、VS、Fpf、VI均小于栽培大豆；野生大豆中VG和(t/bh)2值和小导管比例大于栽培大豆。细胞水平上，栽培大豆茎杆次生壁的厚度大于野生大豆。分子水平上，栽培大豆茎杆中木质素、纤维素和半纤维素含量较高，野生大豆中果胶含量较高。另外，甘露聚糖和甲酯化果胶在茎杆中的分布也存在明显差异，野生大豆的韧皮纤维细胞壁中未检测到甘露聚糖，栽培大豆的果胶甲基酯化程度明显低于野生大豆，这些差异可能是大豆茎杆适应驯化的结果。我们推测栽培大豆茎杆机械强度更强，而野生大豆对环境胁迫的抗性更高。
2.利用SLAF-seq测序技术在亲本和子代中开发了11,398个SNP标记，并构建了覆盖2913.78cM的高密度遗传连锁图，平均遗传距离是0.26cM。木质素和纤维素含量在单个环境中的遗传力较高，多个环境中的遗传力较低，它们的遗传受环境影响较大。一年两点环境下鉴定出8个与木质素含量相关的QTL，如qLC1-1、qLC6-1、qLC11-1、qLC12-1、qLC12-2、qLC12-3、qLC13-1和qLC14-1；另外鉴定出8个与纤维素含量相关的QTL，如qCC1-1、qCC1-2、qCC18-1、qCC19-1、qCC5-1、qCC5-2、qCC9-1和qCC19-2。这些QTL位点仅仅在单个环境中被检测到，多个环境中并没有检测到稳定的QTL。
3.方差分析显示，两年两点环境中籽粒油份和脂肪酸含量的广义遗传力较高。共定位到24个稳定的QTL，其中7个与油份含量相关，如qOC2_1、qOC8_1、qOC8_2、qOC15_1、qOC15_2、qOC20_1和qOC20_2；4个与棕榈酸有关，如qPA10_1、qPA13_1、qPA15_1和qPA16_1；3个与硬脂酸有关，如qSA14_1、qSA14_2和qSA14_3；2个与油酸相关，如qOA11_1和qOA15_1；4个与亚油酸有关，如qLA5_1、qLA5_2、qLA11_1和qLA11_2；4个与亚麻酸相关，如qLNA5_1、qLNA14_1、qLNA15_1和qLNA15_2。其中qPA10_1为新的QTL位点，目前未见报道。这些稳定的QTL中有16个是主效QTL，如qOC15_1、qOC15_2、qOC20_1、qOC20_2、qPA10_1、qSA14_1、qSA14_2、qSA14_3、qOA11_1、qOA15_1、qLA11_1、qLA11_2、qLNA5_1、qLNA14_1、qLNA15_1和qLNA15_2。在15号染色体2.37Mb-5.63Mb的遗传区间内检测到6个QTL，如qOC15_1、qOC15_2、qPA15_1、qOA15_1、qLNA15_1和qLNA15_2，该区间看作是油份和脂肪酸遗传的热点区域。从这些稳定的QTL区间内筛选到96个酶基因和250个转录因子基因可能参与脂质代谢。
4.方差分析显示，除了粒长粒宽比(LW)和粒宽粒厚比(WH)外，三年两点环境中粒重和粒形的广义遗传力较高。共鉴定到24个稳定的QTL，其中5个与粒长相关，如qSL4_1、qSL8_1、qSL12_1、qSL19_1和qSL19_2；3个与粒宽相关，如qSW5_1、qSW7_1和qSW19_1；4个与粒厚相关，如qSH5_1、qSH7_1、qSH15_1和qSH19_1；4个与粒长粒宽比相关，如qLW2_1、qLW2_2、qLW5_1和qLW19_1；3个与粒长粒厚比相关，如qLH2_1、qLH2_2和qLH2_3；1个QTLqWH5_1与粒宽粒厚比相关；4个与百粒重相关，如qHGW4_1、qHGW19_1、qHGW19_2和qHGW19_3。这些稳定的QTL中有11个之前未见报道，可能是新的QTL位点，分别是qSL8_1、qSL12_1、qSH15_1、qLW2_1、qLW2_2、qLW5_1、qLW19_1、qLH2_1、qLH2_2、qLH2_3和qWH5_1。这些稳定的QTL中有11个是主效QTL，如qSL19_1、qSL19_2、qSW19_1、qSH19_1、qLW2_1、qLW2_2、qLW5_1、qLH2_2、qLH2_3、qWH5_1和qHGW19_3。在19号染色体39.42Mb-44.99Mb的遗传区间内检测到7个QTL，分别是qSL19_1、qSL19_2、qSW19_1、qSH19_1、qHGW19_1、qHGW19_2和qHGW19_3，该区间看作是粒重和粒形遗传的热点区域。从这些稳定的QTL区间内筛选出136个蛋白基因和240个转录因子基因可能参与籽粒大小的调控。
5.通过对亲本及其两个极端子代在两个发育时期的样品进行RNA-seq测序，共获得180.49Gb的原始数据，Q30的碱基百分比在93.06%及以上，比对效率在92.18%-96.40%之间。错误发现率FDR＜0.01且差异倍数FC≥2(│Log2(FC)│≥1)作为差异表达基因(DEGs)筛选的标准，共获得14,698个DEGs，其中2,217是新基因。通过DEGs的GO和KEGG富集，筛选到一些跟脂质代谢相关的生物学过程，如脂质代谢调控、酰基甘油代谢、油体生物合成和辅酶代谢等。与籽粒大小相关的生物学过程主要是转录水平和转录后水平调控、激素信号途径、泛素蛋白酶途径和细胞增殖与生长调控等。另外一些与碳代谢相关的途径也得到富集，如碳固定、光合作用、丙酮酸代谢、糖酵解/糖异生等。本文共获得121个和189个候选基因分别与脂质代谢和籽粒大小相关，其中有15个DEGs位于籽粒油份和脂肪酸QTL区间内，14个DEGs位于粒重和粒形QTL区间。另外，权重基因共表达网络分析(WGCNA)共鉴定出6个模块与性状相关联，分别从模块和网络图中筛选到69个和76个候选基因，其中有26个基因位于本研究定位的QTL区间内。
6.通过qRT-PCR对16个候选基因或转录因子基因进行定量分析，其中8个基因可能参与脂质代谢和籽粒大小的调控。例如Glyma.06g068800和Glyma.09g098300基因分别编码ERF和bHLH转录因子。Glyma.10g119900和Glyma.13g287600基因分别编码甘油-3-磷酸酰基转移酶6(GPAT6 )和赤霉素2-氧化酶8(GA2OX8 )。Glyma.14g184900基因功能未知，但位于qLNA14_1区间内。Glyma.17g154500基因可能编码胞内富亮氨酸Ras相关蛋白。这6个基因在籽粒中均有表达，并且栽培大豆中的表达量高于野生大豆，同时其表达量与油份和粒重均呈显著正相关。另外Glyma.07g037700基因编码MYB转录因子，在籽粒中特异表达，该基因位于qSW7_1和qSH7_1区间内，表达量与油份和粒重均呈显著正相关。Glyma.09g111900基因编码脂肪酸去饱和酶(FAD2)，在籽粒和花中特异性表达，其表达量与亚油酸含量显著正相关，与油酸含量显著负相关。