第一章目的采用 532nm倍频激光建立实验性脉络膜新生血管(Choroidal Neovascularization,CNV)动物模型,为CNV的相关基础研究提供模型参考。方法1.应用532nm倍频激光光凝棕色挪威(Brown Norway,BN)大鼠建立实验性CNV模型,分别在光凝后1d、3d、5d、7d、14d、21d采用眼底照、眼底荧光血管造影(Fundus Fluorescein Angiograph,FFA)和吲哚菁绿血管造影(Indocyanine green Angiography,ICGA)观察光凝后不同时间点 CNV 的变化情况。2.制作BN大鼠CNV眼组织病理学标本,采用HE染色法观察光凝后不同时间点CNV中央厚度。3.制作BN大鼠CNV眼组织病理学标本,采用免疫组织化学染色法观察光凝后不同时间点CNV眼组织中CD105因子表达的情况。结果1.光凝后1d光斑处无荧光素渗漏;光凝后3d、5d仅有少量光斑处有荧光素渗漏。光凝后7d CNV生成率为70.18%,荧光素渗漏平均光密度值为128.30±11.21。光凝后14d CNV生成率为78.18%,平均光密度值为182.12±6.59,与光凝后7d组比较差异有统计学意义(P<0.05)。光凝后21d,CNV生成率和荧光素渗漏平均光密度值与光凝后14d组比较差异无统计学意义。2.HE染色结果显示:随着光凝后时间的增加,CNV中央厚度逐渐增加,光凝后7d CNV厚度为48.92±2.81μm,较光凝后1d显著增加(P<0.05);光凝后14d CNV厚度为61.98±5.06μm,较光凝后7d显著增加(P<0.05);光凝后21d CNV厚度为61.78±4.03μm,与14d组比较差异无统计学意义。3.CD105免疫组化结果显示:正常组视网膜组织CD105表达呈阴性,光凝后1d、3d、5d组光斑处可见少量棕黄色反应物表达,光凝后7d组光斑处棕黄色反应物逐渐增多(P<0.05),光凝后14d组较光凝后7d组比较显著增加(P<0.05),光凝后21d组与光凝后14d组比较差异无统计学意义。结论1.应用532nm激光光凝可以成功建立BN大鼠实验性CNV动物模型。2.CNV在光凝后7d至14d生长迅速,至21d逐渐稳定,此模型具有成模速度快,成模率高、重复性好、成本低的优点,可作为CNV基础研究的动物模型。3.眼底照、FFA、ICGA、HE染色和免疫组化检查可以动态观察CNV的变化。第二章目的观察中药单体姜黄素对BN大鼠实验性CNV的抑制作用,以及对AKT/p-AKT/HIF-1 α/VEGF信号通路活性的影响,为姜黄素治疗CNV提供实验依据。方法1.应用532nm倍频激光光凝诱导BN大鼠建立CNV模型,造模后的大鼠被随机分为正常组、模型组、雷珠单抗组、姜黄素低剂量组、姜黄素中剂量组和姜黄素高剂量组,在光凝后14d进行眼底照、FFA与ICGA检查。2.制作BN大鼠CNV眼组织病理学标本,采用HE染色法观察不同组CNV中央厚度。3.制作BN大鼠CNV眼组织病理学标本,采用免疫组织化学法观察不同组CNV眼组织中AKT/p-AKT/HIF-1α/VEGF信号通路各因子蛋白的表达情况。4.采用RT-qPCR法检测CNV眼组织中AKT/HIF-1α/VEGF信号通路各因子mRNA的相对表达量。5.采用蛋白免疫印迹(Western blot)法检测CNV眼组织中AKT/p-AKT/HIF-1α/VEGF信号通路各因子蛋白的相对表达量。结果1.正常组未打激光,模型组,雷珠单抗组,姜黄素低、中、高剂量组CNV生成率分别为78.18%、73.21%、77.19%、75.86%、74.55%,组间比较差异无统计学意义;荧光素渗漏平均光密度值分别为182.12±6.59、119.22±8.03、166.45±8.33、164.34±5.69、149.22±6.45;雷珠单抗组较模型组显著降低(P<0.05);姜黄素低、中、高剂量组较雷珠单抗组显著升高(P<0.05),其中姜黄素高剂量组较模型组显著降低(P<0.05)。2.HE染色结果显示:正常组BN大鼠视网膜组织各层结构清晰、排列整齐。光凝后14d,雷珠单抗组CNV中央厚度较模型组显著减少(P<0.05);姜黄素低、中剂量组与模型组比较差异无统计学意义;姜黄素高剂量组较模型组显著减少(P<0.05),较雷珠单抗组显著增加(P<0.05)。3.免疫组化结果显示:正常组BN大鼠视网膜组织结构中AKT、p-AKT、HIF-1α、VEGF因子表达呈阴性,未见棕黄色反应物。光凝后14d,模型组光斑处AKT、p-AKT、HIF-1α、VEGF因子的表达高于正常组(P<0.05);雷珠单抗组低于模型组(P<0.05);姜黄素低剂量组、中剂量组AKT、p-AKT、HIF-1α、VEGF因子的表达与模型组比较差异无统计学意义;姜黄素高剂量组的表达较模型组显著降低(P<0.05);较雷珠单抗组显著增加(P<0.05)。4.mRNA结果显示:光凝后14d,模型组AKT、HIF-1α和VEGF mRNA相对表达量均高于正常组(P<0.05);雷珠单抗组均低于模型组(P<0.05);姜黄素低、中剂量组与模型组比较差异无统计学意义;姜黄素高剂量组较模型组显著降低(P<0.05),较雷珠单抗组显著增加(P<0.05)。5.Westernblot结果显示:光凝后14d,AKT蛋白各组间比较差异无统计学意义。p-AKT蛋白相对表达量模型组较正常组显著增加(P<0.05);雷珠单抗组较模型组显著降低(P<0.05);姜黄素低、中剂量组与模型组比较差异无统计学意义;姜黄素高剂量组较模型组显著降低(P<0.05)。HIF-1α蛋白相对表达量模型组较正常组显著增加(P<0.05),雷珠单抗组较模型组显著降低(P<0.05),姜黄素低、中剂量与模型组比较差异无统计学意义,姜黄素高剂量组较模型组显著降低(P<0.05),较雷珠单抗组显著增加(P<0.05)。VEGF蛋白相对表达量模型组较正常组显著增加(P<0.05),雷珠单抗组较模型组显著降低(P<0.05),姜黄素低剂量组与模型组比较差异无统计学意义,姜黄素中、高剂量组较模型组显著降低(P<0.05)。结论1.高剂量姜黄素(400mg/Kg/d)对激光诱导的BN大鼠实验性CNV的形成具有抑制作用。2.姜黄素抑制BN大鼠实验性CNV的机制可能与抑制AKT/p-AKT/HIF-1α/VEGF信号通路的激活,降低相关因子的表达有关。第三章目的观察姜黄素对氯化钴(CoCl2)诱导的人视网膜色素上皮细胞株-19(adult retinal pigment epithelial cell line-19,ARPE-19)细胞缺氧模型中 AKT、HIF-1 α 和VEGF因子mRNA及蛋白表达的影响。方法1.采用CoCl2诱导ARPE-19细胞建立化学性缺氧模型,应用CCK-8法筛选造模试剂CoCl2、实验药物姜黄素和阳性对照药雷珠单抗的浓度,同时检测姜黄素对CoCl2诱导的ARPE-19细胞活性的影响。2.将ARPE-19细胞分为正常组、模型组、雷珠单抗组、姜黄素低、中、高剂量组,应用RT-qPCR法检测姜黄素对CoCl2诱导的ARPE-19细胞缺氧模型AKT、HIF-1α和VEGF mRNA表达量的影响。3.将ARPE-19细胞分为正常组、模型组、雷珠单抗组、姜黄素低、中、高剂量组,应用Westernblot法检测姜黄素对CoCl2诱导的ARPE-19细胞缺氧模型AKT、p-AKT、HIF-1α和VEGF蛋白表达量的影响。结果1.CCK-8细胞活性检测:随着CoCl2浓度的增加,ARPE-19细胞活性呈现先增长后抑制,当CoCl2终浓度≥200μM时,细胞活性显著降低(P<0.05)。姜黄素终浓度在0-100μM时,ARPE-19细胞活性未见异常;当浓度≥200μM时,细胞活性显著降低(P<0.05)。雷珠单抗在终浓度为20μg/mL时,细胞活性较CoCl2组显著降低(P<0.05),与正常组比较差异无统计学意义;当浓度为40μg/mL、80μg/mL时,细胞活性较CoCl2组和正常组均显著降低(P<0.05)。因此,我们选择终浓度100μM的CoCl2作为造模浓度;终浓度6.25μM、25μM、100μM的姜黄素作为低、中、高剂量组浓度;终浓度为20μg/mL的雷珠单抗作为阳性对照药物的浓度。2.RT-qPCR结果显示:模型组AKT、HIF-1α和VEGF mRNA相对表达量均高于正常组(P<0.05);雷珠单抗组均低于模型组(P<0.05);姜黄素低、中剂量组与模型组比较差异无统计学意义(P<0.05);姜黄素高剂量组较模型组显著降低(P<0.05);与雷珠单抗组比较差异无统计学意义。3.Westernblot结果显示:AKT蛋白相对表达量各组间比较差异无统计学意义。p-AKT和HIF-1α蛋白相对表达量模型组均高于正常组(P<0.05),雷珠单抗组均低于模型组(P<0.05),姜黄素低、中剂量组与模型组比较差异无统计学意义(P<0.05),姜黄素高剂量组较模型组显著降低(P<0.05),与雷珠单抗组比较差异无统计学意义。VEGF蛋白相对表达量模型组高于正常组(P<0.05),雷珠单抗组低于模型组(P<0.05),姜黄素低剂量与模型组比较差异无统计学意义;姜黄素中、高剂量组较模型组显著降低(P<0.05),与雷珠单抗组比较差异无统计学意义。结论1.应用CoCl2可成功建立APRE-19细胞化学缺氧模型。2.CoCl2在终浓度为100μM时可增加细胞中AKT、HIF-1α和VEGF mRNA及p-AKT、HIF-1α和VEGF蛋白的表达量。3.高剂量姜黄素(100μM)可降低CoCl2诱导的ARPE-19细胞中AKT、HIF-1α和 VEGF mRNA 及 p-AKT、HIF-1α 和 VEGF 蛋白的表达。4.姜黄素(100μM)对CoCl2诱导ARPE-19细胞缺氧具有保护作用。第四章目的观察ARPE-19细胞的各组条件培养液对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)细胞增殖、迁移、侵袭和管腔形成的影响。方法1.将ARPE-19细胞条件培养液分为正常组、模型组、雷珠单抗组、姜黄素低、中、高剂量组,分别作用于HUVEC细胞;采用CCK-8法观察ARPE-19细胞的各组条件培养液对HUVEC细胞活性的影响。2.采用细胞划痕实验观察在非接触情况下ARPE-19细胞的各组条件培养液对HUVEC细胞的水平迁移的影响。3.采用Transwell小室迁移实验观察在非接触情况下ARPE-19细胞的各组条件培养液对HUVEC细胞的垂直迁移的影响。4.采用Transwell小室侵袭实验观察在非接触情况下ARPE-19细胞的各组条件培养液对HUVEC细胞的侵袭的影响。5.采用Matrigel基质胶管腔形成实验,观察在非接触情况下ARPE-19细胞的各组条件培养液对HUVEC细胞管腔形成的影响。结果1.ARPE-19细胞的各组条件培养液对HUVEC细胞活性的影响,组间差异无统计学意义。2.HUVEC细胞水平迁移实验结果显示:与正常组比较模型组HUVEC细胞水平迁移显著增加(P<0.05);与模型组比较雷珠单抗组水平迁移显著减少(P<0.05);姜黄素条件培养液低(6.25μM)、中(25μM)、高(100μM)剂量组水平迁移较模型组显著减少(P<0.05),其中,高剂量组与雷珠单抗组比较差异无统计学意义。3.HUVEC细胞垂直迁移实验结果显示:与正常组比较模型组HUVEC细胞垂直迁移显著增加(P<0.05);与模型组比较雷珠单抗组垂直迁移显著减少(P<0.05);姜黄素条件培养液低(6.25μM)、中(25μM)剂量组垂直迁移与模型组比较差异无统计学意义,姜黄素条件培养液高(100μM)剂量组垂直迁移较模型组显著减少(P<0.05),与雷珠单抗组比较差异无统计学意义。4.HUVEC细胞侵袭实验结果显示:与正常组比较模型组HUVEC细胞侵袭显著增加(P<0.05);与模型组比较雷珠单抗组细胞侵袭显著减少(P<0.05);姜黄素条件培养液低(6.25μM)、中(25μM)剂量组细胞侵袭与模型组比较差异无统计学意义;姜黄素条件培养液高(100μM)剂量组较模型组细胞侵袭显著减少(P<0.05),与雷珠单抗组比较差异无统计学意义。5.HUVEC细胞管腔形成实验结果显示:模型组管腔形成较正常组显著增加(P<0.05);雷珠单抗组管腔形成较模型组显著较少(P<0.05);姜黄素条件培养液低(6.25μM)剂量组管腔形成与模型组比较差异无统计学意义;姜黄素中(25μM)、高(100μM)剂量组管腔形成与模型组比较显著减少(P<0.05),与雷珠单抗组比较差异无统计学意义。结论1.ARPE-19细胞姜黄素低(6.25μM)、中(25μM)、高剂量组(100μM)条件培养液可显著抑制HUVEC细胞水平迁移;其中高剂量组条件培养液可显著抑制HUVEC细胞垂直迁移。2.ARPE-19细胞姜黄素高剂量组(100μM)条件培养液可抑制HUVEC细胞侵袭。3.ARPE-19细胞姜黄素中(25μM)、高剂量组(100μM)条件培养液可抑制HUVEC细胞管腔形成。4.姜黄素可在细胞水平抑制血管的生成。