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在代谢工程中,将酿酒酵母改造为细胞工厂需要构建以及优化外源代谢途径和调整内源代谢网络。然而,酵母已进化出复杂的代谢调控网络,使得外源途径面临着前体不足和酶表达量低等困难,代谢产物产量也相应较低。因此,如何实现外源代谢途径在酵母中的优化表达是研究者们研究的关键问题。目前,开发快速构建以及整合外源代谢途径的方法和引入数学模型来指导优化过程是两个重要的努力方向。本论文通过合理设计开发了一种可实现多基因复杂外源代谢途径快速构建—组装—整合的方法,将其命名为YeastFab(Yeast Fabrication)技术。同时本论文还建立人工神经网络集成模型来指导外源代谢途径的优化,利用YeastFab技术构建菌株并进行实验验证,用得到的数据训练模型,然后利用该模型来预测更加优化的代谢途径,最终实现代谢产物在酵母细胞内的高效合成。本论文开发的YeastFab技术具有高通量、易于操作和可在酵母中稳定高效整合整条代谢途径等优点,并可在一周内完成从克隆到测试表达整个流程。首先,对三个功能元件启动子(PRO)、开放阅读框(ORF)和终止子(TER)进行标准化,分别克隆到标准的载体上;其次,基于Golden-Gate方法,将任意三种元件一步拼接为基因转录单元(TU);最后,根据代谢通路中TU的数量,通过不同的方案将代谢通路中全部基因一次或分次整合到酵母内的特定位点。此外,本文还通过在整合位点引入双链断裂,进一步提高了整合效率。本论文还建立了人工神经网络集成模型,结合YeastFab技术对外源代谢途径进行优化。首先,利用YeastFab技术构建一定数量具有不同启动子的代谢途径,获取数据来训练模型;然后,利用模型来预测代谢途径中各个TU的最适启动子强度,实验验证预测组合,并用获得的数据进一步修正模型,提升模型的预测能力,最终实现模型对优化代谢途径的指导。以β-胡萝卜素途径为例,以占库总量(10~3)约2%的初始菌株库(~20)的数据训练模型,预测得到最优菌株经验证,其β-胡萝卜素产量较初始菌株库中最佳菌株的产量提升了65%,模拟和预测效果良好。综上所述,本论文开发了可实现外源代谢途径快速构建并整合到酵母中的YeastFab技术,并将该技术应用于外源代谢途径的优化。同时选取人工神经网络集成模型预测外源代谢途径并指导其优化,实现了生产效率的提高,证明了模型指导与实验技术相结合在细胞工厂中巨大的应用潜力。