论文部分内容阅读
背景及目的:神经胶质瘤是最常见的原发颅内恶性肿瘤,具有高发病率,高复发率,高死亡率和低治愈率等特点。尽管包括外科手术,放疗和化疗在内的治疗方法均被运用于治疗神经胶质瘤患者,患者预后仍不理想。除了传统的治疗方法,近几年针对胶质瘤的分子治疗展开了大量研究。大量的实验研究证明,在不同级别的胶质瘤细胞中多种基因差异性表达,并进一步证明了大部分基因参与调控胶质瘤细胞增殖、侵袭和凋亡的过程。这些基因包括非编码基因MicroRNA-184,mi R-218-5p和MicroRNA-16;和编码基因AKT,PTEN和NFKBIA。非编码RNA分子(ncRNAs)的异常表达参与不同肿瘤的生长进程。ncRNAs主要分为两种类型:长链非编码RNA分子(LncRNAs),核苷酸序列长度>200bp和短链非编码RNA分子(MicroRNAs),核苷酸序列长度为19-25bp。相对于MicroRNAs,LncRNAs在各种肿瘤中研究较少,部分研究证明LncRNAs在各种类型肿瘤中可起到促进肿瘤生长或抑制肿瘤生长的作用;同样,一些研究也证明了LncRNAs在胶质瘤生长,发展过程中起到了至关重要的调节作用。我们前期通过对SHG139和SHG139S的基因芯片数据分析发现:LncRNA-ZNF281在SHG139和SHG139S中差异性表达。LncRNA-ZNF281是LncRNAs家族中的一员,其核苷酸序列长度为353bp,位于染色体1q32.1,核苷酸片段位点为200443207-200443559。但LncRNA-ZNF281对胶质瘤细胞的增殖、侵袭、凋亡和血管生成及其调节机制还未进行深入的研究。本研究我们将探索LncRNA-ZNF281在胶质瘤细胞中的结构特性和生物功能,以及影响胶质瘤细胞生长、发展的分子机制。为临床上用于诊断胶质瘤、判断胶质瘤预后和治疗胶质瘤提供靶点及理论基础。研究方法:在80例胶质瘤标本和5例非瘤脑组织标本中(取自苏州大学第一附属医院2010年1月-2013年12月神经外科手术切除的胶质瘤组织),通过实时定量PCR(RT-PCR)检测LncRNA-ZNF281的表达情况。其中,包括28例低级别胶质瘤组织(WHOⅡ,星形细胞瘤24例、少突胶质细胞瘤4例)和52例高级别胶质瘤组织(WHOⅢ,星形细胞瘤23例、间变性少突胶质细胞瘤2例、间变型室管膜瘤2例;WHOⅣ,胶质母细胞瘤23例、髓母细胞瘤2例)。其中,男性48人(WHOⅡ16例、WHOⅢ17例和WHOⅣ15例),平均年龄为47.98岁;女性32人(WHOⅡ12例、WHOⅢ10例和WHOⅣ10例),平均年龄为48.91岁。用病毒增强液将载有LncRNA-ZNF281基因片段的慢病毒转染至SHG139和U87细胞中,同时设立空白及阴性对照组,分别通过RT-PCR、流式细胞仪和荧光显微镜检测转染前后胶质瘤细胞株SHG139和U87中VEGF、MMP2和LncRNA-ZNF281的表达情况及转染效率。CCK-8法检测细胞的增殖能力,流式细胞仪分析细胞周期与凋亡;transwell实验检测SHG139和U87的侵袭能力;Western Blot检测转染前后VEGF、MMP2、Caspase-3、BCL-2和CyclinD1表达情况,肿瘤异种移植实验验证LncRNA-ZNF281对体内肿瘤生长的影响,免疫组化检测VEGF、MMP2、Caspase-3和Ki-67表达情况。结果:1.LncRNA-ZNF281在基因芯片、脑胶质瘤及胶质瘤细胞株中表达水平基因芯片数据分析显示LncRNA-ZNF281在SHG139和SHG139S中差异性表达,并且具有统计学意义。运用实时定量PCR技术,对5例非瘤脑组织、80例不同级别的胶质瘤组织和胶质瘤细胞株(A172、SHG44、SU2、U87、U251和SHG139)中的LncRNA-ZNF281表达水平进行检测。其结果提示:在胶质瘤组织中LncRNA-ZNF281的表达水平比非瘤脑组织低(P<0.05)。并且随着肿瘤级别增高,LncRNA-ZNF281表达水平逐渐降低。LncRNA-ZNF281在胶质瘤细胞株(A172、SHG44、SU2、U87、U251和SHG139)中的表达水平均低于非瘤脑组织(P<0.05)。2.病毒转染效率将载有LncRNA-ZNF281基因片段的慢病毒转染至SHG139和U87细胞中,通过RT-PCR、流式细胞仪和荧光显微镜检测发现转染病毒后的胶质瘤细胞中LncRNA-ZNF281的表达水平较空白组和对照组增高,并且转染效率均大于80%(P<0.05)。3.上调LncRNA-ZNF281的表达水平可抑制胶质瘤细胞的增殖、侵袭和迁移胶质瘤细胞株SHG139和U87在转染慢病毒后,增殖能力较空白对照组和阴性对照组细胞有所下降;流式细胞仪检测细胞周期发现:相对于空白对照组和阴性对照组细胞,高表达LncRNA-ZNF281组的胶质瘤细胞更多阻滞在G1/G2期,而处于S期的胶质瘤细胞所占比例降低。同时,上调LncRNA-ZNF281组细胞比对照组细胞具有更弱的侵袭能力和迁移能力。4.上调LncRNA-ZNF281的表达水平促进胶质瘤细胞凋亡通过流式细胞仪检测上调LncRNA-ZNF281组胶质瘤细胞、阴性对照组胶质瘤细胞和空白对照组胶质瘤细胞的凋亡率。数据分析发现,相对于对照组胶质瘤细胞,上调LncRNA-ZNF281组胶质瘤细胞有更高的凋亡率,并且具有统计学意义。5.LncRNA-ZNF281在胶质瘤细胞中调控VEGF和MMP2表达水平VEGF是目前公认的胶质瘤血管生成调控基因,通过qRT-PCR和Western Blot检测转染病毒前后的胶质瘤细胞中VEGF的表达水平,实验数据显示上调LncRNA-ZNF281组的胶质瘤细胞表达更低水平的VEGF mRNA和VEGF蛋白质。同时,MMP2在基因芯片中也是差异性表达,并且与LncRNA-ZNF281联系较为紧密。通过qRT-PCR和Western Blot检测不同组别胶质瘤细胞,发现在上调LncRNA-ZNF281组胶质瘤细胞中表达更低水平的MMP2 mRNA和MMP2蛋白质。6.LncRNA-ZNF281在胶质瘤细胞中调控Caspase-3、BCL-2和CyclinD1表达水平基于上述研究结果,可得出LncRNA-ZNF281对胶质瘤细胞增殖、侵袭、凋亡和细胞周期具有调控作用。为了探索LncRNA-ZNF281对胶质瘤生长、发展的调节机制,我们探索LncRNA-ZNF281与增殖、侵袭、凋亡、细胞周期的相关调节基因(Caspase-3、BCL-2和CyclinD1)的关系。通过qRT-PCR和Western Blot检测发现上调LncRNA-ZNF281的表达水平可抑制BCL-2和CyclinD1 mRNA和蛋白表达水平,促进Caspase-3 mRNA和蛋白表达水平。7.在体内实验中,LncRNA-ZNF281调控VEGF、MMP2、Ki-67和Caspase-3蛋白表达水平为了通过体内实验再次验证LncRNA-ZNF281对胶质瘤生长的调节作用,我们构建裸鼠移植瘤模型。在转染慢病毒组,从裸鼠的左前肢皮下所取得皮下肿瘤的体积和重量明显小于阴性对照组的肿瘤。HE染色证明了颅内肿瘤的形成,并通过免疫组化验证在转染慢病毒组中VEGF、MMP2和Ki-67蛋白表达水平低于阴性对照组;Caspase-3蛋白表达高于阴性对照组。结论:(1).LncRNA-ZNF281在人脑胶质瘤组织和胶质瘤细胞株(A172、SHG44、SU2、U87、U251和SHG139)中表达水平明显低于非瘤脑组织。并且随着肿瘤级别增高,LncRNA-ZNF281表达水平逐渐降低;尤其在胶质母细胞瘤标本中,LncRNA-ZNF281表达水平最低。(2)在体外和体内试验中,上调LncRNA-ZNF281可通过调控Ki-67的表达水平来抑制胶质瘤细胞株U87和SHG139的增殖;过表达LncRNA-ZNF281可通过调控VEGF和MMP2的表达水平抑制胶质瘤细胞株U87和SHG139的侵袭;上调LncRNA-ZNF281可通过调控BCL-2、Caspase-3和CyclinD1的表达水平来促进胶质瘤细胞株U87和SHG139的凋亡。