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镉(Cadmium,Cd)作为重金属物质广泛应用在工业生产活动中,并随之排放至水体、土壤等环境中。Cd可以通过日常用品接触、吸烟、食物摄取等途径进入人体并蓄积,具有代谢半衰期较长,毒性较大的特点。长期以来人们对Cd毒性已有非常深入的研究,然而,Cd作为一种广为人知的致癌物和促癌物,其具体的毒性机理尚不非常明确。近年来随着表观遗传学研究理论和技术的发展,很多研究表明表观遗传修饰,尤其是DNA甲基化与Cd的致癌性密切相关。在许多活体和细胞中进行的实验发现,Cd进入机体后通过诱导DNA甲基转移酶(DNMTs)表达,促进许多抑癌基因诸如p16、p53、PTEN等启动子区甲基化,降低其表达水平,最终导致细胞的恶性增殖或出现其他癌症特征。而Cd是否会通过提高抑癌基因启动子区甲基化的水平促进人肝癌细胞HepG2的增殖尚不得而知;若Cd确实可以通过改变部分抑癌基因启动子甲基化诱导HepG2细胞的增殖,发挥关键作用的基因和位点也尚待确定。为了探讨上述问题,本研究以人肝癌细胞HepG2为研究材料,通过不同浓度的Cd对其进行不同时间处理后,利用MTT法筛选出Cd促细胞增殖最为明显的浓度及时间;利用实时定量PCR(RT-qPCR)技术检测癌细胞恶性增殖相关基因COX-2和Ki-67的表达,确定Cd对HepG2细胞的增殖作用;利用甲基化特异性PCR技术检测了CDKN2A、RASSF1A和DAPK1等3个增殖相关基因的启动子甲基化水平;利用RT-qPCR技术检测了甲基化发生改变的两个基因RASSF1A和DAPK1以及三个重要的甲基转移酶DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的表达水平;用甲基化测序技术检测了RASSF1A和DAPK1基因启动子区234 bp和375 bp的一段CpG岛的甲基化水平;同时,设有Cd和甲基化抑制剂5-氮杂胞苷(5-AZA)联合处理组,用以研究DNA甲基化在Cd诱导HepG2细胞增殖中发挥的作用。我们的研究结果显示,125至1000 nM Cd处理均会促进细胞增殖,而500 nM,96小时处理组细胞增殖最为显著,达151.7%,且在125至500 nM浓度范围内,Cd对细胞增殖有一定的剂量效应;Cd与5-AZA联合处理后细胞增殖受到明显的抑制,表明DNA甲基化在Cd诱导的HepG2细胞增殖中发挥作用;通过MSP检测到Cd可以促进抑癌基因RASSF1A和DAPK1基因启动子的甲基化;各浓度Cd均可以降低RASSF1A和DAPK1的表达,各浓度Cd处理组RASSF1A表达均显著降低,250和500 nM Cd处理组DAPK1表达显著降低,5-AZA部分恢复DAPK1和RASSF1A的基因表达水平。Cd单独处理组三种DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的表达均上升,Cd与5-AZA联合处理组DNMTs表达较Cd单独处理组表达更高;而甲基化测序结果表明500 nM Cd处理促进了DAPK1和RASSF1A启动子的高甲基化,5-AZA处理则使得上述两个基因的启动子区甲基化水平得以恢复,而且,DAPK1检测区域内第83位(Chr9:90,113,207)、108位(Chr9:90,113,231)和275位(Chr9:90,113,395)CpG以及RASSF1A的第104位(Chr3:50,374,481)可能在Cd诱导的HepG2细胞增殖中发挥关键作用。综上所述,低浓度Cd(125至500 nM)可以促进HepG2细胞的增殖,在这一过程中,抑癌基因RASSF1A和DAPK1等基因启动子甲基化导致其低表达,且存在四个位点可能在这一现象中起到关键作用,此外造成启动子区高甲基化抑制RASSF1A和DAPK1表达的原因是DNMTs表达升高。本研究旨在进一步阐明Cd在促进癌症发生过程中的分子机制,为评价和研究Cd毒性机制提供一定表观遗传学基础。