前言:自1981年发现艾滋病以来，艾滋病(AIDS)在全球迅速扩散，人免疫缺陷病毒(HIV)是引起AIDS的病原体。绝大多数人感染HIV8-10年后会逐渐进入艾滋病期，但有约5％的感染者尽管感染HIV已10年以上，未经抗逆转录病毒治疗，CD4+T细胞仍维持正常水平，无艾滋病特征性症状，称为长期不进展者（LTNPs）。HIV-1感染者疾病进展情况受病毒本身、宿主遗传及免疫学等多种因素影响，而目前对其机制仍不明确。研究认为HIV-1感染者体内的病毒复制水平是影响疾病进程的主要因素之一。转录是病毒复制过程中必不可少的环节，因而病毒转录水平对疾病的进展有重要影响，对病毒转录调控的研究有助于明确影响疾病进展的病毒学因素。　　 LTR是HIV-1的转录调控启动子(long terminal repeat)，是结构为U3-R-U5的顺向重复序列单位，其三个单位共组成五个功能域，包括：远距离调节单位，增强子单位，核心启动子单位，R区的Tat反应元件(TAR)和U5之后的gag引导序列，功能域又由多个转录因子结合域组成。在转录因子的帮助下，LTR可以促进并调节前病毒的转录，所以该区域的基因多态性会影响病毒复制及疾病进程。转录因子中的SP家族蛋白对LTR转录功能的发挥尤为重要，若该结合域的突变会影响SP与LTR的有效结合而延缓疾病进程。同样，NF-kB蛋白会促进HIV病毒在活化的T淋巴细胞中的表达。　　 病毒自身tatl区编码的Tat蛋白第一外显子对在辅助LTR完成转录功能时发挥重要作用。在复制早期，病毒依赖自身的启动子LTR完成转录，当Tat蛋白合成出现后，依靠其基础区和7个半胱氨酸与TAR结合，调节了RNA聚合酶H和NF-κB活性，使得转录活性得以提高，这些重要氨基酸位点对于Tat蛋白功能的发挥，特别是与cyclin T1结合，在核酸中的定位，与其他转录协同因子结合以及酶活性调节上都起着举足轻重的作用。　　 两种相同或不同亚型的HIV同时感染细胞时，重组毒株即可形成，且可能会成为优势株在人群中广泛传播，因其遗传及生物学特征的改变而成为特殊的毒株存在。我国目前流行的B/C重组株主要为CRF07_BC和CRF08_BC，但是尚无关于其LTR序列特征的研究。国外对CRF01_AE、B亚型的LTR和tat第一外显子编码区基因的多态性与HIV感染后疾病进展的相关性研究发现，LTR区段存在缺陷的毒株可以延缓疾病进程，SP1和USF结合域的多态性与疾病进展存在关联，但LTR转录活性与疾病进程无显著相关性。目前缺乏对B/C重组株基因多态性的研究，且对其转录活性与疾病进展关系的研究仍属空白。　　 自1989年云南省在边境地区静脉注射吸毒人群中首次报告146例艾滋病病毒感染者以来，截止2010年10月底，云南省累计报告艾滋病病毒感染者/病人超过8.2万人，其中艾滋病病毒感染者6.2力多例，艾滋病疫情仍十分严峻。云南德宏地区存在一些特殊的B’/C重组株，因其重组位点不同于CRF07BC和CRF08_BC，而被称为不典型重组。鉴于以往的研究多是着眼于该重组株的结构基因，本研究将重点放在与病毒转录相关的LTR，tatl基因以获取新的数据资料，探索B’/C不典型HIV-1毒株在LTR，tatl区的特征，并从病毒转录角度出发，探索影响疾病进展的因素。　　 方法:　　 1、研究对象:我国云南德宏地区HIV-1感染者，男性23人，女性1人；年龄25-54岁（平均年龄38）；除1例为异性传播感染外，其余23例均为静脉吸毒感染者。根据CD4+T细胞数量和感染时间将样本分为长期不进展者和典型进展者。　　 2、CD4+T淋巴细胞测定:20μlCD4/CD8/CD3 TriTEST试剂加入TruCOUNT管中，加入50ul抗凝血，室温避光15min，加入免沈溶血素450μ1，室温避光15min，用FACSMMLTISET软件检测并进行自动分析、计算CD4+、CD8+、CD3+T淋巴细胞绝对值及相应比值等。　　 3、病毒载量测定:用Roche公司HIV-1 Monitor1.5 Commercial kit试剂盒在Cobas Amplicor全自动载量仪上测定。（＞99.85％的特异性，检测线性范围为50-750，000拷贝/mL，可用于HIV-1 M组A-G亚型的定量检测）　　 4、病毒核酸提取:以抗凝200μl全血提取前病毒基因DNA，按照QIAamp Viral DNA MiniKit说明书步骤提取DNA，提取物溶于50μl洗脱液中。所有离心步骤均在室温进行。得到的RNA样品直接进行逆转录或在-80℃保存备用。　　 5、巢氏聚合酶链反应(nest-PCR)LTR:外侧引物SLTR、HAR，内侧引物SLTR、MSR7。tatl外侧引物TatOF、TatOR，内侧引物TatIF、TatIR。　　 6、PCR反应产物纯化:取终产物5μl进行1％琼脂糖凝胶电泳，经Ultra-Violet Product凝胶成像后与marker比对，确认所需片段，用QIAquik Gel Extraction Kit试剂盒纯化基因片段。　　 7、TA克隆:扩增的LTR、tatl基因片段插入克隆载体pMDTM18-T Simple Vector，转入化学感受态菌DH5a扩大培养，然后提取质粒DNA双脱氧终止法测序。　　 8、核酸序列测定和序列结果分析:测得的序列用sequencher软件对每个样品的LTR，tatl核苷酸序列进行拼接。用BioEdit软件进行编辑校正，用Clustal X程序将样品序列进行序列比对，alignment程序获得共享序列。用MEGA4软件进行系统树分析。　　 9．双酶切并将目的片段连入pGL4.10载体、转化、提取质粒:挑选出两组中存在差异的位点对应的阳性克隆，用限制性内切酶NheI、XhoI进行双酶切。将纯化后的DNA与pGL4.1014℃过夜连接。转化及质粒提取同前。Fugen转染试剂将质粒转入293T细胞。荧光素酶检测试剂与细胞作用，于微孔板光度计读取发光值，以荧光素酶活性单位(RLU)反应LTR转录活性。　　 10.统计学分析:用SPSS17统计软件对样本信息中的CD4+T细胞数量、感染时间和病毒载量进行均值的独立样本T检验，p＜0.05有统计学意义。用SPSS17中Yates校正的x2检验并计算P值或双尾Fishers精确概率检验LTR基因多态性和Tat第一外显子氨基酸多态性在两纽问的差异是否有统计学意义。相关性分析LTR转录活性与病毒载量的关系。　　 结果:　　 一、研究对象人口学及其流行病学资料　　 24例样本均来自于云南德宏地区，LTNP组CD4+T数量、感染时间明显高于TP组，两组VL无明显差异。　　 二．LTR、tatl基本序列特征　　 LTR、tatl系统进化树显示，24例样本中有19例在这两个区段内均与C亚型及CRF08_ BC毒株在同一簇内，且该19例样本的gag、 pol序列提示其为B’/C不典型重组株。用基因距离方法进一步分析这19例B7C不典型重组株LTR、tatl区与各参考株的亲缘关系。这两个区段均与印度C和CRF08_BC有较高的同源性，且与印度C的亲缘关系更近。　　 三．B’/C不典型重组株LTR、tatl多态性与疾病进展的关系　　 不同疾病进展组间LTR存在多个具有显著性差异的碱基突变。TP组USF功能域中的A291C/T和APl/CREB-1功能域中C604T突变率显著高于LTNP组，而RBF-2功能域中A336T/G突变只发生在LTNP组。还有3个未知功能域发生碱基突变，且在两组间存在显著性差异。Tat第一外显子71个氨基酸在两组间均无显著性差异，但与转录相关的重要氨基酸位点中存在一些变化。第31位氨基酸位点上，一些B’/C不典型重组株发生C31S，但不存在显著性差异。另外在基础区中，18例样本均十分保守，只有TP组的216053发生了S57R突变。　　 四．B’/C不典型重组株LTR转录活性与基因多态性及疾病进展的关系　　 单一的碱基突变不会改变转录水平。比较不同疾病进展组间的转录活性差异显示，TP组转录活性有高于LTNP组的趋势。　　 五．B’/C不典型重组株Tat第一外显子对病毒转录作用的预测　　 本实验以2DIT为模板，利用SWISS-MODEL网上工具构建Tat第一外显子的空间结构。结果提示C31S突变可以改变Tat第一外显子的空间结构，而R57S未能使其结构发生改变。　　 结论:　　 1．中国云南德宏地区B’/C不典型重组株LTR、tatl区与印度C亚型毒株有高度同源性；　　 2．中国云南德宏地区呈现出不同疾病进展状态的B’/C不典型重组株HIV-1感染者，其体内毒株的LTR多个功能域的基因多态性存在显著性差异；　　 3．中国云南德宏地区B’/C不典型重组株HiV-1感染者中，典型进展组的病毒转录活性水平有高于长期不进展组的趋势；　　 4．中国云南德宏地区B’/C不典型重组株Tat第一外显子C31S可以改变其空间结构，影响其转录激活作用。