脑血管疾病(cerebrovascular disease, CVD)是神经系统的常见病和多发病,死亡率占所有疾病的10%,是目前人类因疾病死亡的三大原因之一。在我国,每年死于脑卒中的人数超过100万,占我国人口死因的首位(占22.45%),50%-70%的存活者留有瘫痪、失语等严重后遗症,给社会和家庭带来沉重负担。脑血管疾病可分为缺血性卒中和出血性卒中。缺血性卒中是目前最常见的,约占中风的80%-90%。缺血性卒中是以脑局部血液循环障碍、血流量减少为特征的一种病变。据统计,缺血性中风70%以上是由颅内或颅外大血管的急性阻塞引起。因此,尽快恢复缺血区的血流灌注是急性缺血性中风治疗的基本原则,溶栓治疗正是在此基础上建立起来的行之有效的方法。传统观念认为早期主要采取溶栓治疗,时间窗为3小时以内,旨在使闭塞动脉再通来恢复缺血区的血流灌注,以拯救尚能存活的脑组织,改善病人预后。目前,以组织型纤溶酶原激活剂为基础的急性溶栓治疗,是唯一通过美国食品及药品管理局认证的方法,已被越来越多的临床医生接受并应用于临床。与此同时也带来了一些溶栓相关的问题,如颅内出血、再闭塞和缺血再灌注损伤等并发症。静脉内溶栓治疗,颅内血管部分或完全再通率,颈内动脉仅10%,大脑中动脉约为25%。出血和血管再闭塞是影响溶栓治疗的主要原因。特别是症状性出血,有较高的发生率(6%)和严重的后果迫使医学工作者对这一方法重新审视。尽管试验结果再次证实了急性期溶栓治疗的疗效,但严格的治疗时间窗限制,却使临床上大多数病人不能从中受益,症状性出血成为急性缺血性脑卒中溶栓治疗应用的最大障碍。PROACT临床试验证实动脉内溶栓治疗对于改善预后有效,并且在血管再通方面有优势,但出血和再通血管的闭塞仍然是主要问题。近年来,随着病理生理过程的进一步认识及药物学、血管内介入治疗技术的发展,血管内溶栓治疗日益受到重视,但仍存在许多不尽完善之处,包括材料的选择、治疗时间窗以及超选择血管内溶栓药物的选择、用量、速率等,都是亟待解决问题。人类缺血性卒中在病因、发病部位、临床表现上有很大变化,因此模拟临床疾病的发病过程,建立稳定、可靠、重复性好、费用低廉、方法简单,发病机制和病理生理类似于人类血栓栓塞性脑梗死,更适用于缺血性脑血管病治疗学及溶栓药物的评价的模型,一直是人们普遍关注的课题。近年来随着实验动物科学的不断发展,该领域的研究已取得了长足的进步。自体血栓栓塞和溶栓治疗模型的建立有利于进一步研究缺血性脑血管病的病理生理改变和治疗效果。脑血管造影、核磁共振弥散成像技术、神经功能缺陷评分和脑梗死体积在脑缺血和溶栓治疗模型中保证实验成功率和准确性,具有重要的作用。血小板在急性缺血性脑病中扮演重要的角色,抗血小板聚集治疗是基本措施。对于血管再通后的再闭塞问题,通过抗血小板或抗凝治疗能够解决,但最佳药物的选择、剂量、用药时间和方式等问题一直存在争议。75%的脑血栓栓子是“白血栓”,即富含血小板和纤维蛋白。急性新鲜的血小板血栓(白色血栓)使用传统的抗凝药(肝素)和溶栓剂(尿激酶等)是无效的。在心血管领域已有大量的临床循证医学证据表明,GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂在急性冠脉综合征(ACS)和经皮冠状动脉介入治疗(PCI)抗栓中的疗效和安全性。血小板糖蛋白GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂是一类新型抗血小板聚集药物,它通过抑制纤维蛋白原(Fg)与GPⅡb/Ⅲa特异性结合,这是引起血小板聚集的最后共同通路,有效地阻止各种途径诱导的血小板聚集,从而达到最大程度的抗血小板作用。近年来,国外GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂已经单独或联合纤溶药物静脉注射用于急性脑缺血疾病改善溶栓治疗效果和防止血管再闭塞,减少溶栓并发症的的发生。临床试验研究证明GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂在急性缺血性卒中中使用无明显增加颅内出血的几率,甚至在心肺旁路手术中使用替罗非班都是安全的。溶栓不可避免的要激活凝血系统,导致缺血性脑卒中溶栓病人血栓再形成,使脑组织灌注不完全或延迟再灌注,微循环功能紊乱,甚至血管再通后闭塞,出现神经功能恶化。有研究发现替罗非班可以抑制微循环血栓形成,减少溶栓后组织无复流现象的发生。在急性大脑中阻塞病人中rtPA联合替罗非班静脉输注可使68%病人阻塞的大脑中动脉再通,随访脑组织缺血性损伤明显减小,神经功能明显改善,症状性出血率大约7%-8%。替罗非班已经常规用于尿激酶动脉内溶栓和机械性取栓的辅助治疗。早期的一项研究使用阿昔单抗,肝素和阿司匹林治疗心肌梗死病人,发现能提高梗塞血管的血流。推测GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂通过使聚集的血小板解聚,改变了血栓的结构,使血栓发生了内源性的溶栓过程。在脑血管病血管内介入治疗过程中血栓栓塞的发生率为3-10%,永久性神经功能损伤的发生率为3-5%。在这类病人溶栓是一个棘手的难题,尤其是在出血性疾病,例如颅内动脉瘤破裂的病人。替罗非班是非肽类小分子,特异性强,生物半衰期短,反复使用不易发生免疫反应。并且其起效快,给药后5分钟对血小板的抑制作用可达96%,停药后4小时内作用消失,血小板功能恢复。Li ebeskind DS等曾静脉内单独使用替罗非班成功治疗一例椎基底动脉急性栓塞rtPA溶栓效果不理想的病人。韩国医生Tae Jin Song在颈内动脉狭窄放置支架后因血栓形成引起颈动脉再阻塞,使用纤溶药物效果不理想,动脉内注射替罗非班后很快血栓溶解,血管再通。最近,有病例报道在破裂或未破裂动脉瘤血管内介入治疗中发生急性缺血性并发症,动脉内超选择注射GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂取得满意效果。以上研究均支持替罗非班有抗血栓形成的功能,动脉内注射安全。动脉内注射替罗非班取得了令人鼓舞的效果,但仅是个案探索,需要进一步的证明效果和安全性。脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor, BDNF)为生物体内天然的蛋白分子,具有防止神经元死亡功能的一种蛋白质,主要由神经元和神经胶质细胞产生,是神经营养因子家族的重要成员。研究表明,在脑损伤后,除了存在一种主动性的程序性细胞凋亡过程,在耐受细胞内还存在一种平行的主动性神经元存活过程,脑源性神经营养因子(BDNF)就参与了这种主动性神经元存活过程。动物实验研究表明BDNF反应性增强是机体早期神经元对缺血、缺氧的自我保护。脑缺血损伤时,BDNF在梗死灶周围的“半暗区”甚至远隔区域均有显著表达,梗死灶核心BDNF永久性降低；缺血后12h梗死灶边界的内侧BDNF免疫反应性暂时性升高。国内此类报道亦较不一致,但大多集中在12-24h为其表达高峰,48h开始下降,表明BDNF在神经元损伤修复与再生中起重要作用。如果我们针对脑组织局灶性缺血损伤后,早期采取积极有效措施,改善缺血区脑组织的血液循环,防止脑组织缺血区神经元继续变性坏死,提高内源性BDNF表达水平,对脑缺血损伤后神经元的保护有重要意义。目前,缺血性脑病GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂基本是静脉用药,关于动脉内用药的效果、安全性,以及使用剂量,国内外鲜有报道。盐酸替罗非班作为一种高效、高选择性的GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂,作用机制新颖、临床疗效确切、安全性好,是一种极有发展前途的治疗药物。本课题分二部分进行。第一部分为替罗非班联合尿激酶超选择动脉内溶栓的动物实验研究,实验分二步进行：实验一研究了血管内介入技术制作兔大脑中动脉闭塞模型的方法,并评价其技术上的可行性和稳定性；实验二研究了替罗非班联合尿激酶超选择动脉内溶栓治疗兔急性大脑中动脉栓塞的疗效和安全性。采用X线数字减影(DSA)观察动脉内超选择溶栓的血管再通率、核磁共振弥散成像观察相对表观弥散系数(rADC)、改良Bederson评分法观察神经功能缺损。24h后处死动物,经氯化—2,3,5—三苯基四氯唑染色,作光镜病理形态学检查。第二部分研究了替罗非班在临床溶栓治疗中的应用、疗效和安全性,试验分二部分进行：试验一研究了替罗非班联合尿激酶在应用电解弹微簧圈栓塞治疗破裂动脉瘤中并发急性血栓形成经血管内介入溶栓治疗的疗效和安全性；试验二研究了替罗非班联合尿激酶血管内介入治疗颅内静脉窦血栓形成的疗效和安全性。实验研究一介入技术制作兔大脑中动脉闭塞模型的研究目的建立一种家兔大脑中动脉闭塞动物模型并经影像学诊断证实,而后行动脉内超选择接触性溶栓治疗,并评价其技术上的可行性和稳定性。方法用改良腰穿针穿刺并搔刮兔耳动脉内膜形成自体血栓,用眼科手术刀将其切为0.5mm×0.4mm大小备用。分离麻醉固定后的家兔股动脉,将微导管经股动脉插入,在数字减影血管造影(DSA)透射下插入颈内动脉,经微导管注射兔自体动脉血栓建立兔大脑中动脉闭塞模型。采用DSA观察脑血管阻塞情况、MRI观察脑梗死部位、范围、改良Bederson评分法观察神经功能缺损。24h后处死动物,光学显微镜与透射电了显微镜观察病理改变。结果所有家兔成功建立大脑中动脉栓塞模型,脑梗死灶均位于同侧大脑半球,局限于顶叶皮质、皮层下及基底节区,栓塞后的动物均存活24h。24h处死时测量脑梗死体积占对侧大脑半球的(44.08±5.13)%。TCI检查造模前平均流速(Vm)与造模后2h Vm和造模后5h Vm之间均存在显著差异(P=0.000和P=0.000)。造模后2h和造模后5h之间Vm无显著差异(P=0.908)。TTC染色、病理及MRI检查均发现脑组织脑梗死病灶部位一致。结论血管内介入技术制作兔大脑中动脉自体血栓栓塞模型具有创伤小、易存活、栓塞可靠、脑梗死体积适中的优点。具有良好的可重复性和可控性,可用于脑梗死的早期诊断及药物溶栓研究。实验研究二兔急性大脑中动脉栓塞替罗非班联合尿激酶超选择动脉内溶栓的实验研究目的探讨替罗非班联合尿激酶超选择性动脉内溶栓治疗急性大脑中动脉栓塞的疗效和安全性。方法健康雄性成年日本大白兔60只,体重2.5-3.Okg,采用自体血栓栓塞大脑中动脉制成急性脑梗塞模型,随机分为替罗非班组(T组)、尿激酶组(UK组)、替罗非班+尿激酶组(T+UK组)和对照组(C组),共四组。每组又随即分为两组即A(10只)、B组(5只),T组：在脑缺血后2h通过颈内动脉内微导管,缓慢推入生理盐水30mL+替罗非班5u g/kg,30min内推完;UK组：在脑缺血后2h通过颈内动脉内微导管,缓慢推入生理盐水30mL+尿激酶20000U/kg,30min内推完；T+UK组：脑缺血后2h通过颈内动脉内微导管,生理盐水15mL+替罗非班3u g/kg及生理盐水15mL+尿激酶10000U/kg交替缓慢推入,30min内推完；CG组：脑缺血后2h经微导管缓慢推入生理盐水30mL,30min内推完。A组采用X线数字减影(DSA)观察动脉内超选择溶栓的血管再通率、核磁共振弥散成像(diffusion-weighted imaging, DWI)观察相对表观弥散系数(relative apparent diffusion coefficient, rADC)、改良Bederson评分法观察神经功能缺损。24h后处死动物,A组经氯化—2,3,5—三苯基四氯唑(TTC)染色测量脑梗死灶的体积,B组行光学显微镜、电子显微镜和脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)免疫组化病理学检查。结果替罗非班+尿激酶组(T+UK组)血管再通率为90%,病理检查未见明显出血。替罗非班+尿激酶组(T+UK组)rADC值与对照组、替罗非班组和尿激酶组之间均存在显著差异(P=0.000,P=0.000和P=0.011)；神经功能缺损评分替罗非班+尿激酶组与对照组、替罗非班组和尿激酶组之间均存在显著差异(P=0.000,P=0.000和P=0.029)；脑梗死面积百分率替罗非班+尿激酶组与对照组、替罗非班组和尿激酶组之间均存在显著差异(P=0.000,P=0.029和P=0.002)。均优于尿激酶组(UK组)、替罗非班组(T组)和对照组(CG组)。免疫组化BDNF显示：替罗非班+尿激酶组(T+UK组)BDNF表达较对照组(C组)、替罗非班组(T组)尿激酶组(UK组)增加,差异具有统计学意义(P=0.000,P=0.000和P=0.001)。电镜结果显示替罗非班+尿激酶组(T+UK组)神经元核形态基本正常,线粒体轻度肿胀,嵴增大。替罗非班组(T组)、尿激酶组(UK组)均显示神经元变性,细胞器中度肿胀,线粒体中度肿胀,嵴增大,数目减少,个别线粒体嵴断裂、消失。对照组(C组)可见神经元核固缩、核染色质溶解,细胞结构消失。结论早期使用替罗非班联合尿激酶对兔超早期脑缺血模型给予动脉内溶栓治疗,其疗效肯定、安全,能完全或部分恢复脑动脉再通,明显减少脑梗塞体积,改善微循环并减少脑出血的发生率,优于单纯尿激酶动脉内溶栓。临床研究一颅内动脉急性血栓形成时替罗非班联合尿激酶超选择动脉内溶栓的临床研究目的研究在颅内破裂动脉瘤行弹簧圈栓塞过程中并发血栓形成,应用替罗非斑联合尿激酶动脉内介入溶栓治疗的疗效和安全性。方法2010年5月至2012年2月有12例颅内动脉瘤破裂患者行弹簧圈介入栓塞治疗过程中并发急性血栓形成,完成动脉瘤栓塞后。于血栓形成1小时内,在DSA监视下,12例患者均给予替罗非班联合尿激酶动脉内超选择溶栓,以及机械性碎栓治疗。每10min行造影观察血管溶通情况,直至血管完全或部分再通。结果本组病人除1例为椎动脉系外,其余均为颈内动脉系统闭塞。溶栓后即刻完全再通9例,术后48h头颅CT无颅内出血,1例轻度神经功能障碍,其余无明显神经功能缺失；1例血管部分再通,少量斑块残留,术后24h头颅CT无颅内出血,有轻度神经功能障碍,恢复期因心肌梗死死亡；1例血管完全再通,术后立即头颅CT示右侧额叶脑出血,左侧肢体瘫痪,保守治疗3月症状改善后出院；1例大部分血管再通,术后24h头颅CT示脑梗塞、急性脑水肿,行去骨瓣减压,术后3月残留右侧肢体偏瘫。结论颅内动脉急性血栓形成,甚至是破裂动脉瘤栓塞过程中急性血栓形成,替罗非班联合尿激酶超选择溶栓治疗是安全、有效的治疗手段。临床研究二替罗非班联合尿激酶超选择静脉窦内溶栓的临床研究目的探讨替罗非斑联合尿激酶超选择颅内静脉窦内溶栓的安全性和有效性。方法对9例颅内静脉窦血栓形成患者行替罗非班联合尿激酶性超选择静脉窦内溶栓、机械性破栓治疗。结果8例患者的症状、体征明显改善,其中头痛消失7例,1例症状改善,死亡1例；出院前8例患者测脑脊液压力正常,血管造影检查证实7例患者静脉窦主干通畅,皮层静脉和深静脉恢复正常;1例部分再通。结论替罗非班联合尿激酶超选择颅内静脉窦内溶栓是安全、有效的治疗手段。