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胶质母细胞瘤（Glioblastoma,GBM,WHOⅣ级）是最常见的中枢神经系统原发性肿瘤之一,恶性程度高、治疗困难且易复发、患者预后极差。胶质瘤干细胞（Glioma stem cell,GSC）是一群具有自我更新和多向分化能力,可始动肿瘤发生的细胞亚群,被认为是GBM发生、复发及治疗抵抗的“种子”。它一方面能不断进行自我更新及分化,产生异质性的肿瘤细胞群体;另一方面,由于其侵袭能力极强、处于静止期、高表达抗凋亡分子等特征,可抵抗传统治疗,导致现有针对GBM的治疗策略（手术治疗、放疗、化疗等）远期疗效欠佳。因此,寻找特异性针对GSC的治疗靶点,阐明GBM恶性进展的分子机制,有助于研发更为有效的GBM治疗策略。代谢异常是恶性肿瘤细胞最重要的特征之一。近年研究表明,肿瘤细胞中存在脂代谢异常。例如,正常大脑无脂滴累积,而胶质瘤样本可见到大量脂滴。基于TCGA数据库的分析发现,脂代谢相关基因在不同级别胶质瘤中呈现差异性表达。此外,在小鼠成熟神经干细胞中,FAO（Fatty acid oxidation）是调控神经干细胞干性维持与分化的重要途径。然而,与正常干细胞相比,GSC脂代谢特征如何尚待进一步研究。CPT1A是CPT1的一个亚型,定位于线粒体外膜,是FAO的限速酶,主要在人体肝、脑等组织表达。研究报道,GBM存在CPT1A异常表达。然而,在GBM中CPT1A异常表达的意义,其是否调控GSC干性及其机制并不清楚。因此,本课题研究了GSC脂代谢特征,敲低CPT1A对GSC干性的调控作用及机制,并分析了人胶质瘤组织中CPT1A表达及其临床病理学意义。研究思路及结果如下:一、成功建立体外GSC分化模型,发现GSC分化过程中伴有脂肪酸积累增加首先,我们建立了体外GSC分化模型,分别于诱导分化第0、1、3、5、7天,通过Western blot检测星形胶质细胞标志物GFAP和GSC干性标志物SOX2、OLIG2表达。结果显示,GFAP表达随着分化时间延长而逐渐上升,相反,GSC干性指标SOX2、OLIG2的表达随分化时间延长逐渐下降,提示GSC分化体系建立成功。我们进一步通过BODIPYTM脂滴荧光染色,观察GSC分化的不同时间点胞内脂滴及脂肪酸累积情况。在未分化的GSC中几乎检测不到脂滴,随着GSC分化时间延长,细胞内脂滴累积呈逐渐增加趋势;脂肪酸的变化趋势和脂滴一致,在未分化的GSC中脂肪酸含量较低,分化至第7天时,细胞内脂肪酸含量增多至分化第0天的2倍左右。以上研究结果提示:在GSC分化过程中,脂滴及脂肪酸积累逐渐增加。二、GSC分化过程中增多的脂肪酸以长链脂肪酸为主鉴于GSC分化过程中脂肪酸积累逐渐增加,我们进一步通过质谱分析鉴定了GSC分化过程中细胞内积累的脂肪酸类型。结果显示,GSC积累的脂肪酸主要为长链脂肪酸,包括十五烷酸、十七碳烯酸、亚油酸、花生四烯酸、二十四碳烯酸等。三、外源性脂肪酸促进GSC分化我们进一步向GSC中添加外源性脂肪酸并观察其对GSC生物学特性的影响。添加外源性脂肪酸可导致GSC中脂滴增多。通过Western blot检测添加外源性脂肪酸后不同时间点GSC干性指标与分化指标的表达情况。结果提示:与对照组相比,诱导分化不同时间点,星型胶质细胞标记物GFAP表达增高,干性指标SOX2、OLIG2下降。以上结果提示:向GSC培养环境中添加外源性脂肪酸促进GSC分化。四、敲低CPT1A抑制胶质瘤干细胞分化我们使用慢病毒敲低CPT1A,通过Western blot检测GSC干性指标与分化指标的表达情况,结果提示:敲低CPT1A导致干性标记物SOX2、OLIG2表达显著增高,分化标记物GFAP表达量明显降低。以上结果提示:敲低CPT1A抑制GSC分化。我们在GSC中敲低CPT1A,或利用CPT1A的抑制剂Etomoxir（ETO）处理GSC,通过免疫荧光标记GSC线粒体外膜蛋白TOM20,定量分析处理前后线粒体面积与周长,评估抑制CPT1A对线粒体形态的影响。结果显示,与对照组相比,两个CPT1A敲低组线粒体面积减少了34%、27%,线粒体周长减少了34%、25%。加入终浓度为50μM、100μM、200μM的ETO后,GSC线粒体面积（基本不变、减少39%和30%）和周长（减少5%、39%、29%）减少。以上数据表明,抑制CPT1A表达或活性,线粒体面积和周长均减少,提示线粒体发生裂变。五、CPT1A低表达于CD133阳性GSC细胞,且与胶质瘤恶性程度呈负相关。最后,我们比较了胶质细胞与GBM细胞中CPT1A蛋白表达,发现GBM细胞中CPT1A表达较低。通过免疫荧光染色对胶质瘤组织中CPT1A和CD133进行双重标记,发现在CD133阳性GSC中,CPT1A表达水平较低。通过分析TCGA数据库结果发现CPT1A在GBM中表达水平与胶质瘤级别呈负相关（p<0.01）。以上数据表明,CPT1A在CD133阳性GSC中低表达,并与胶质瘤恶性程度呈负相关。综上所述,本研究提示在GSC分化过程中长链脂肪酸累积增多,敲低CPT1A,线粒体发生裂变,胶质瘤细胞干性增强。因此,CPT1A有望成为靶向GSC治疗GBM的有效靶点。