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实验一：结直肠锯齿状病变的Wif-1基因甲基化状态及β-catenin蛋白的表达 [背景与目的]： 在结直肠息肉/腺瘤中存在一组特殊的息肉/腺瘤,其隐窝呈锯齿状形态,称为锯齿状病变。由于细胞凋亡调节机制受到抑制,上皮细胞不断生长堆积,凸向腺腔,形成微乳头状的内折结构,从而构成锯齿状形态[3]。新版WHO(2010)消化系统肿瘤分类明确将锯齿状病变分为三种类型：增生性息肉(hyperplastic polyps,HPs)、广基锯齿状腺瘤/息肉(sessile serrated adenoma/polyp,SSA/P)及传统锯齿状腺瘤(traditional serrated adenoma,TSA)。其中HP根据黏液类型不同又分为微小泡状型HP(microvesicula HP,MVHP)、杯状细胞型HP(goblet cellric HP,GCHP)和黏液缺乏型HP(mucin poor HP,MPHP),SSA/P根据有无异型性又分为SSA/P不伴异型增生(sessile serrated adenoma/polyp without atypia)和SSA/P伴异型增生(sessile serrated adenoma/polyp with atypia)[4]。目前认为锯齿状癌变可能存在两条途径[2,5,6],一条称为广基锯齿状通路,主要为BRAF基因突变,一般发展为MVHP和SSA/P,病变倾向于CpG岛启动子区域甲基化,引起一系列基因沉默,当MLH1基因沉默时SSA细胞异型性发展很快,随后便发生恶变。另一条为传统锯齿状通路,与BRAF基因突变不相关,可能为K-ras基因突变,包括GCHP和TSA,关于GCHP所知很少,有研究认为TSA的MGMT基因甲基化后,发展为低微卫星不稳定(microsatellite instability-low)MSI-L癌。然而目前仍缺乏其他相关基因甲基化在锯齿状病变中的研究。 Wnt/β-catenin信号通路具有调控细胞生长增殖的重要作用,现已发现其异常激活与人类多种肿瘤的发生关系密切[7]。Wif-1(Wnt inhibitory factor-1) 是该通路的拮抗基因。Wif-1基因启动子区高甲基化状态在多种肿瘤中都已检出,Wif-1作为一种肿瘤抑制基因(tumor suppressor gene,TSG),其启动子区的高甲基化参与了肿瘤的发生发展。在结直肠癌中,国内外文献报道Wif-1启动子区的甲基化率较高,但尚无Wif基因在结直肠锯齿状病变中甲基化状况的报道。 本文首次通过观察各组锯齿状病变的Wif-1基因甲基化状态和β-catenin蛋白表达,比较各组锯齿状病变与CRC及正常结肠组织有否差异,旨在探讨Wif-1甲基化与β-catenin表达以及与结直肠锯齿状病变发生发展的关系,并探讨检测Wif-1基因甲基化对锯齿状病变的辅助诊断作用。 [方法]： 收集北京军区总医院2007-08—2011-12间的结肠镜活检诊断为息肉和腺瘤的标本4417例。所有切片按WHO(2010)标准,由3名病理医师4～5轮阅片,从中筛选出锯齿状病变共586例,并将以上锯齿状病变分为增生性息肉(hyperplastic polyps,HPs)、广基锯齿状腺瘤/息肉(sessile serrated adenoma/polyp,SSA/P)和传统锯齿状腺瘤(traditional serrated adenoma,TSA)。从中筛选出HP52例、SSA41例、TSA23例,并取24例CRC和24正常结直肠黏膜组织作为对照进行β-catenin免疫组化染色。同时从上述各组中分别抽取HP29例、SSA29例、TSA19例、CRC14例和正常结直肠黏膜组织16例,提取组织DNA进行亚硫酸氢纳修饰,应用SYBR Green PCR法检测Wif-1基因启动子区甲基化状态。 [结果]： 对免疫组化结果进行统计学分析,显示β-catenin异常阳性率在正常结直肠黏膜(12.5％)、HP(59.6%)、SSA(63.4%)、TSA(73.9%)及CRC组(100%)中逐渐上升,其中HP、SSA及TSA各组分别与正常结直肠黏膜、CRC组比较,差异显著(P<0.05)。对SYBRGreenPCR结果进行统计学分析,显示Wif-1基因启动子区甲基化率在正常结直肠黏膜组织(12.5%)、HP(34.5%)、SSA(55.2%)、TSA(78.9%)及CRC组(92.9%)中逐渐上升,其中Wif-1基因甲基化率在HP(34.5%)、SSA组(55.2%)中低于CRC组(92.9%),在SSA(55.2%)、TSA组(78.9%)中高于正常结直肠黏膜(12.5%),在HP组(34.5%)中低于TSA(78.9%),差异均显著(P<0.05);在锯齿状病变中SYBRGreenPCR法检测Wif-1基因甲基化的灵敏度为53.2%,特异度为87.5%。将锯齿状病变中Wif-1基因甲基化率与β-catenin异常阳性率进行统计学分析,显示二者有明显相关性,且相关性主要表现在48例锯齿状腺瘤中(P<0.05)。 [结论]： 1.免疫组织化学结果显示β-catenin异常阳性率在锯齿状病变中明显升高,提示β-catenin作为Wnt信号通路的关键分子,其异位表达增加使细胞黏附功能降低,可能参与锯齿状癌变的过程。 2.SYBRGreenPCR结果显示Wif-1基因甲基化率在锯齿状病变中明显升高,提示其启动子区甲基化致Wif-1表达缺失,激活Wnt/β-catenin信号通路,可能在SSA发生发展、HP的进展及TSA的发生过程中发挥重要作用。Wif-1基因甲基化可能成为锯齿状病变的分子标志物,检测该基因甲基化状态有望成为锯齿状病变的辅助诊断之一。 3.锯齿状腺瘤中Wif-1基因甲基化与β-catenin蛋白表达有明显相关性,提示Wif-1基因启动子区甲基化可能是引起β-catenin异常表达的机制之一。 实验二：结直肠增生性息肉的临床病理及免疫组化特征 [背景与目的]： 结直肠癌(colorectal cancer,CRC)严重危害人类健康,近年来其发病率不断攀升。最新研究显示,60%的CRC来自APC基因突变的普通腺瘤,另35%来自CpG岛甲基化表型(CIMP)的锯齿状腺瘤,还有5%来自Lynch 综合症[1]。其中较受关注的锯齿状病变是结直肠息肉/腺瘤中的一组特殊类型,其隐窝呈锯齿状形态。由于细胞凋亡调节机制受到抑制,上皮细胞不断生长堆积,凸向腺腔,形成微乳头状的内折结构,从而构成锯齿状形态[2]。WHO(2010)消化系统肿瘤分类明确将锯齿状病变分为三类：增生性息肉(hyperplastic polyps,HPs)、广基锯齿状腺瘤/息肉(sessile serrated adenoma/polyp,SSA/P) 及 传 统 锯 齿 状 腺 瘤 (traditional serrated adenoma,TSA)。其中 HP 根据黏液类型不同又分为微小泡状型 HP(microvesicula HP,MVHP)、杯状细胞型HP(goblet cellric HP,GCHP)和黏液缺乏型HP(mucin poor HP,MPHP) 。 近年来,除经典腺瘤-腺癌通路之外,增生性息肉-锯齿状腺瘤-腺癌的锯齿状癌变通路逐渐被人们所接受。该通路中又存在两条途径,即MVHP可能为SSA/P的前期病变,由BRAF基因突变、MLH1基因甲基化致高微卫星不稳定(MSI-H),继而进展为癌;而GCHP与TSA一样存在K-ras基因突变,MGMT基因甲基化致低微卫星不稳定(MSI-L),从而发展为癌。目前各组HP发生及其进展的分子机制尚不十分明确,仍需更多研究。 本研究通过观察各组HP的临床病理特征及一组与结直肠癌变通路相关的蛋白(包括信号转导RUNX3、Wnt信号通路β-catenin、细胞周期调节因子p16、错配修复基因MLH-1、DNA损伤修复基因MGMT、胃肠胚胎遗传学通路CDX2及增殖指数Ki-67)在52例HP中的表达情况,比较各组HP与对照组及HP三组亚型间的差异,归纳各组HP临床病理诊断要点,探讨各组抗体表达与HP发生发展的关系,并筛选出有助于诊断HP的抗体。 [方法]： 收集北京军区总医院2007-08—2011-12间的结肠镜活检诊断为息肉和腺瘤的标本4417例,所有切片按WHO(2010)标准,由3名病理医师4～5轮阅片,从中筛选出锯齿状病变共586例。再对上述586例锯齿状病变切片进行组织学诊断及分类,筛选出HP共207例,其中MVHP157例,GCHP48例,MPHP2例。从以上各组中抽取MVHP38例、GCHP12例和MPHP2例作为实验组,同时抽取SSA/P41例、TSA23例、结直肠腺癌(CRC)24例和正常结直肠黏膜组织24例作为对照组。标本经10%中性甲醛固定,常规石蜡包埋,4μm厚连续切片,HE染色。免疫组化MaxVision两步法。 [结果]： HP占所收集锯齿状病变的35.3%(207/586),多发生于左半结肠约40.6%(84/207),直径范围0.1～0.3cm。镜下可分为MVHP、GCHP和MPHP3种亚型,主要表现为大部分腺腔有锯齿状结构,隐窝拉长,多呈管状,隐窝上部腔缘呈锯齿状,增生部分位于基底及下1/3,隐窝下1/3狭窄,间隔被覆未分化细胞及神经内分泌细胞。免疫组化结果显示,在HP中RUNX3、p16的阳性率存在不同程度的减低,β-catenin的异常阳性率明显升高,而Ki-67出现表达部位及表达数量异常的程度较轻,其中MPHP增殖活性较高,MLH1阳性率在MVHP与SSA间不等,差异显著(P<0.05)。 [结论]： 1.HP较常见,多发生于左半结肠,体积常较小。 2.形态学观察结果主要为大部分腺腔有锯齿状结构,增生部分位于基底及下1/3,隐窝下1/3狭窄,间隔被覆未分化细胞及神经内分泌细胞。 3.免疫组化结果提示RUNX3、p16及β-catenin异常表达可能有助于诊断HP;MPHP可能具有一定的恶性潜能,应得到临床医生的重视并加强该类患者的随诊管理;MVHP可能不是SSA的前期病变。