地球表面的70%被海洋所覆盖,海洋沉积物构成了最复杂的微生物生境,其中蕴藏着丰富的微生物资源,据统计,地球上总的微生物中,位于深海沉积物中的超过50%。深海(除热液口外)和极地海洋是一个高盐、低温的极端环境,微生物在这种极端环境条件下生存,必须进化出独特的适应机制,因而这些微生物在物种、基因组成和生态功能上具有多样性。研究海洋沉积物中的微生物的多样性对阐述全球的生物地球化学循环是十分关键的。沉积物中有机氮的降解是海洋生态系统氮循环的重要环节。在海洋中,生物合成的高分子量有机氮(High-Molecular-Weight Organic Nitrogen, HMWON)以颗粒有机氮(particulate organic nitrogen, PON)的形式,从海水表层沉降到沉积物中。PON在微生物的作用下降解为高分子量的溶解有机氮(dissolved organic nitrogen, DON), DON再经过微生物的分解、氨化、硝化和反硝化作用,最终完成整个氮循环,微生物在整个过程中起着关键的作用,其中硝化反应是氮循环的限速反应,该步骤的关键酶是氨单加氧酶,编码该酶的基因为amo,编码该酶a亚基的基因amoA经常被用作研究亚硝化类群的分子标记。因此,海洋沉积物中PON的降解在沉积物整个氮循环过程中具有非常关键的作用,蛋白质是沉积物中PON和DON的重要组成部分,因此产蛋白酶细菌在他们的降解过程中起重要作用。对海洋沉积物中微生物、蛋白酶的研究和amoA基因多样性的研究对于最终阐明沉积物中氮的循环机制和开发新型蛋白酶具有重要的意义。本论文分别对中国南海的8个沉积物样品和中国南极长城站附近海域的8个沉积物样品的微生物多样性、所产蛋白酶多样性以及长城站附近沉积物样品中的amoA基因多样性进行了系统研究,并分析了中国南海沉积物菌株Bacillus sp. CF12-9分泌的蛋白酶Ba-1的酶学性质。一、中国南海沉积物中产蛋白酶细菌和蛋白酶的多样性用酪蛋白明胶培养基,从中国南海水深154-2,456m不等的8个海洋沉积物样品中筛选产蛋白酶的细菌菌株。根据平板上生长的菌落数统计,沉积物中可培养的产蛋白酶细菌的丰度大约为106个/g,表明在沉积物里存在着大量的产蛋白酶细菌。总共筛选得到不同的菌株78株,对这些菌株16S rDNA序列进行测序,并提交至NCBI GenBank数据库,登录号为FJ169962-FJ170039。序列分析表明,除了两株菌属于Firmicutes(厚壁菌门)的Bacillus属,另外的76株均属于Gammaproteobacteria纲的Pseudoalteromonas、Alteromonas、Marinobacter、 Idiomarina、Halomonas、Vibrio、Shewanella、Pseudomonas或Rheinheimera属。其中Alteromonas属(34.6%)和Pseudoalteromonas (28.2%)属为优势属。其余的属分别占了所有菌株的2.6%到7.7%。并且还发现,在不同位点和不同水深的沉积物里的细菌优势菌是不同的。在最浅的位点E505,主要的产蛋白酶细菌属是Shewanella,占该位点所有菌株数的60%,而在所有超过1000m深的沉积物样品中,主要的产蛋白酶菌为Pseudoalteromonas和Alteromonas。针对筛选到的Gammaproteobacteria菌株,从GenBank数据库里搜索相近菌16S rRNA基因序列,结果显示,菌株与GenBank中最为接近的16S rRNA序列大部分来自没有命名的菌株或者未培养的海洋细菌。有一些菌株,如CF12-14、E505-2、E505-8和E407-8,与其他的已经鉴定的细菌种有着非常远的进化距离,这些菌株可能是一些新种。经过进一步的研究,CF12-14和E407-8已经分别被鉴定为Idiomarina属和Rheinheimera属的新种。有62株菌能够产生足够量的酶用于进行蛋白酶抑制剂实验。分析丝氨酸蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF),金属蛋白酶抑制剂邻菲罗啉(o-phenanthroline,O-P),半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64和天冬氨酸蛋白酶抑制剂pepstatin A对这些菌株产的蛋白酶活性的抑制效果。结果显示,PMSF对所有研究菌株产的蛋白酶的活性都有抑制作用,抑制率为23-100%,表明这些菌株都能够产生丝氨酸蛋白酶。O.P对47株菌产生的蛋白酶的活性有抑制作用,抑制率为20-84%,表明这些菌株都能够产生金属蛋白酶。大部分菌株产生的胞外蛋白酶的活性能够同时被PMSF和O-P抑制,表明了这些菌株能够同时产生丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。E-64和pepstatin A对菌株产的蛋白酶活性的最高抑制率低于10%,或者无抑制,这表明这些菌株不产或者产极其少量的半胱氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。因此,海洋沉积物中细菌产的胞外蛋白酶可能都是丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。另外,研究了这些菌株产的胞外蛋白酶对酪蛋白、明胶和弹性蛋白的降解能力。结果表明,有68株菌能够在酪蛋白或者明胶平板上产生明显的水解圈,这些蛋白酶对酪蛋白和明胶的降解能力明显不同。仅有47株菌能够在弹性蛋白平板上产生较为显著的水解圈。有一些菌株产的蛋白酶对三种蛋白均有较高的降解活力,比如菌株CF6-2、CF6-14、E505-3、CF12-10和E407-8.进一步研究发现菌株Pseudoalteromonas sp. CF6-2分泌的蛋白酶Pseudoalterin是一个序列新颖的M23家族金属蛋白酶。以上结果表明,这些菌株产的蛋白酶可能属于不同种类的丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶,其中存在着一些新型的蛋白酶。二、南极菲尔德斯半岛海域沉积物的微生物多样性我们采集了中国南极长城站附近Maxwell湾海洋沉积物样品,利用qPCR技术对沉积物中的细菌及古菌的16S rDNA及amoA基因序列进行了定量分析,并利用454焦磷酸测序对沉积物中的微生物群落进行了分析。沉积物中,细菌16SrDNA的丰度远远超过古菌的,说明了细菌在采集的海洋沉积物样品中的优势地位。对8个样品中的细菌和古菌的16S rDNA序列进行测序,总共得到了181231条细菌16S rDNA和95118条古菌16S rDNA序列,提交至NCBI SRA数据库,登录号为SRP017144。在8个样品的群落里,细菌和古菌的OTU数量分别为2516-4278和403-1221个,该结果和Shannon指数、Simpson指数均表明了在所有样品的群落中,细菌的多样性高于古菌的多样性。Good’s coverage指数显示,测序得到的序列包含了细菌类群总数的87.6%-92.5%和古菌类群总数的94.2%-98.8%。在沉积物样品中总共发现了23个细菌门和2个古菌门。其中,细菌的优势类群为Firmicutes和Proteobacteria,分别占了所有序列的61.3%和17.9%,在所有的8个样品中均出现的共有17个科或类群,这些类群总计占了每个样品细菌群落的92%以上。在所有的样品的古菌群落里,均发现了泉古菌(Crenarchaeota)和广古菌(Euryarchaeota),除了样品SS9,沉积物中最多的古菌是广古菌。Mthanomicrobia (40.2%)、Halobacteria(27.7%)、Group C3(12.1%)和Marine Benthic Group B (11.4%)是主要的古菌类群。值得注意的是,有大量的序列不能归入任何一个目(order),尤其是在SS8、SS9和SS13样品中,该比例分别达到38.6%、70.1%、45.8%,说明在南极沉积物中有着大量新的类群。细菌和古菌的VWeighted UniFrac PCoA分析表现出了极其不同的样式,表明沉积物中的细菌和古菌群落可能受不同因素的影响。细菌amoA基因拷贝数比细菌16S rRNA基因拷贝数低4-5个数量级,古菌的amoA基因则未能扩增到目的片段,说明沉积物中氨氧化细菌所占比例较少,而氨氧化古菌更少,以致qPCR定量方法检测不到,这与454焦磷酸测序的分析结果是一致的。构建了细菌amoA基因的克隆文库,总计得到了85条序列,分为8个OTU,其中三个较大的OTU(?)总计有78条序列。搜索NCBI数据库和构建系统发育树表明,样品中检测到的氨氧化细菌的amoA基因均与Nitrosomonadaceae科关系较近,表明样品中氨氧化细菌的多样性较低。三、南极菲尔德斯半岛海域沉积物中产蛋白酶细菌及蛋白酶的多样性从南极菲尔德斯半岛海域沉积物样品中筛选到了203个不同的菌株,对这些菌株的16S rDNA序列测序,得到的序列提交至NCBI GenBank数据库,登录号为：KC160632-KC160834。其中有98株能够在酪蛋白明胶筛选平板上生长,但是不能形成水解圈,另外105株细菌能够形成水解圈,用于后续分析。105株细菌分别属于23个属,其中5株细菌——菌株SS9.12、SS9.38、SS14.29、SS14.30和SS14.31,它们在进化树上聚为一簇,并且在NCBI数据库中没有关系相近的Bacteroidetes (?)属,这可能代表了Bacteroidetes (?)下一个较新的分类单元。在属的水平上,每个样品中的细菌都表现出较高的多样性。这些细菌属于Firmicutes、Bacteroidetes、Actinobacteria和Proteobacteria四个门。总体来说,Bacillus (22.9%)、Flavobacterium (21.0%)和Lacinutrix (16.2%).是优势属,几乎在每个样品中均有发现,并且形成了丰度最大的类群,这三个属总共有63株,占了总数的60%。有14个属只有一个菌株,占到了全部菌株的16.2%。并且,结果显示,在不同的样品里产蛋白酶细菌的优势菌群是不同的。多达85株菌在液体发酵培养基中产酶量低,不能进行蛋白酶的抑制剂实验,其余20株细菌的蛋白酶抑制剂实验表明沉积物中的细菌产生的蛋白酶均为丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。这个结果与南海沉积物样品的是一致的。筛选到的105株细菌中,57株细菌只能形成微弱的水解圈,只有48株能够在筛选平板上形成明显水解圈,它们对酪蛋白和明胶的降解能力展现出了极大的不同,表明这些菌株产的蛋白酶可能属于不同种类的丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。综上所述,南极沉积物中的细菌产蛋白酶的能力与南海沉积物中的相比较低。四、菌株Bacillus sp. CF12-9产的胞外蛋白酶Ba-1的分离纯化和酶学性质研究Bacillus sp. CF12-9是从南海沉积物中分离到的一株高产蛋白酶的菌株。蛋白底物固体平板分析表明,该菌株对酪蛋白、明胶和弹性蛋白都有较强的降解能力。我们通过液体发酵,收集发酵液,并利用阴离子交换层析的方法,分离纯化了菌株Bacillus sp. CF12-9产的一个胞外蛋白酶Ba-1.底物特异性分析显示,该酶对不同的蛋白质底物如酪蛋白、明胶、胶原蛋白和弹性蛋白均有降解活性,该酶的最适酶活温度为30℃,在0℃时,仍然能保持35%左右的活性,表明该酶为典型的适冷蛋白酶,该酶的最适pH为8.5。蛋白酶抑制剂实验表明该酶属于丝氨酸蛋白酶。2mM的K+或Li+能抑制该酶约20%的活性,2mM的Zn2+能够抑制该酶活性的30%左右,2mM的Fe2+能够明显的抑制该酶的酶活,抑制率在80%以上。该酶在无NaCl时酶活最高,0.5M的NaCl(?)能抑制该酶活性的20%,说明该酶对NaCl的耐受性较差。对Ba-1进行N端测序,获得了该蛋白酶N端前15个氨基酸残基序列：WTPNDYYYQGYQYGP,(?)将得到的序列在NCBI上进行BLAST序列比对,初步确定蛋白酶Ba-1属于丝氨酸蛋白酶subtilisin家族(S8A)。根据N端序列,设计兼并引物为正向引物,使用S8A家族保守区引物RM6为反向引物,扩增得到了Ba-1编码基因的N端到保守区的片段,利用TAIL-PCR技术扩增得到Ba-1的基因序列,全长为1215bp,编码了404个氨基酸,分析显示,M1-A27为信号肽,E55.T124为I9peptidase inhibitor,W125-Y404为成熟酶。与该蛋白酶氨基酸序列相似度最高的为B.sp.Ak.1产的蛋白酶Ak.1protease和Geobacillus stearothermophilus产的胞外蛋白酶,相似度高达72%,Ak.1protease和Geobacillus stearothermophilus产的蛋白酶均在60-70℃保持稳定,并且是热激活蛋白,而Ba-1在35。C保温30min几乎丧失所有的活性。因此,Ba-1与这两个酶的性质差别很大。以上结果为进一步阐述蛋白酶在深海氮循环中发挥的作用提供了有力的理论依据,并且该酶作为典型适冷酶在需要低温催化的领域可能有一定的应用前景。本论文使用高通量测序的方法研究了极地海洋沉积物中微生物的多样性,并构建了沉积物中细菌amoA基因的克隆文库,对两种截然不同的海洋沉积物—热带海洋和极地海洋的沉积物中的产蛋白酶细菌和这些细菌产的胞外蛋白酶进行了多样性的研究,对南海沉积物来源的Bacillus sp. CF12-9产的蛋白酶的酶学性质进行了分析,本论文为阐述海洋沉积物中的氮循环机制提供了一定的理论依据。