土传病害拮抗菌筛选、选育及基因组分析

来源 :中南林业科技大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:wanghuia23
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辣椒是世界上最重要的蔬菜作物之一,有广泛的用途,既可鲜食,又可作调味。但部分土传病害,严重威胁着辣椒及其他经济作物种植的产量,及品质好坏。人们长期使用化学药剂防治辣椒土传病害,不仅造成了病原菌的抗药性,而且造成了环境污染等问题,随着国际上食品安全和环境安全问题日益严重,各个国家的农业部门也越来越重视生物肥料和生物杀虫剂的使用。因此,找到能够减少化学农药的使用、且安全有效的替代品成为国际上的研究热点。近年来,植物根际促生菌(PGPR)及其生物活性抗菌化合物能拮抗或促进植物生长,被普遍认为是一种环境友好、易于生物降解的抗菌剂。1.以辣椒白绢病病原真菌(Sclerotium rolfsii)为靶标菌,辅以辣椒疫病病菌(Phytophthora capsici)、油茶炭疽病(Fusarium lini)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)三种植物病原菌验证,从不同地区辣椒根际土壤中分离出26株具有生防潜力的拮抗细菌,筛选出IBFCBF-5菌株的生防潜力最强,其对辣椒白绢病的抑菌圈直径可达18.6 mm,抑菌率为46.5%;对其他3种病原真菌也均具有明显的抑制作用,菌圈直径均在10 mm以上。为探究菌株生防能力机制,使用辐射诱变60Co—γ射线在野生菌的基础上筛选出一株突变菌TBFCBF-6,该菌对辣椒白绢病、辣椒疫病病菌、油茶炭疽病、黄瓜枯萎病菌有明显防治效果,且对辣椒白绢病的抑菌圈直径可达22.00 mm,较原始菌株IBFCBF-5提升18.28%。对两株菌进行鉴定,结合形态学特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析,可初步确定俩菌株为解淀粉芽孢杆菌,英文名为Bacillus amyloliquefaciens。2.然后别对野生菌IBFCBF-5和突变菌TBFCBF-6进行全基因组测序和重测序。全基因组测序分析表明野生菌IBFCBF-5有一个4,338,658bp的环状DNA,其碱基G+C含量为46.05%;预测总共有4546个基因,其中含有4341个编码DNA序列,205个非编码RNA;将预测的得到的基因提交基础数据库进行功能注释,Nr数据库结果进一步验证菌株IBFCBF-5属于解淀粉芽孢杆菌;GO数据库显示菌株IBFCBF-5在“生物过程”中代谢过程占57%,其中和拮抗物质代谢相关基因占0.8%;COG和KEGG数据库注释显示菌株IBFCBF-5新陈代谢功能基因占比最大。3.通过对突变菌株TBFCBF-6重测序分析,定位到参考菌株IBFCBF-5上的序列长度达93.09%。在编译类型SNP中,CDS区变异数达36749个,其中同义编码突变有28955个,占78.97%,碱基替换方式T:A>C:G占比最大;在Small Indel变异类型中,总数为460个,在CDS编码区变异的数目最多的是移码突变,占总数的68.70%。4.差异对比分析显示野生菌IBFCBF-5在所有数据库中注释得到的基因数为7967个,突变菌TBFCBF-6为7732个;各数据库基因注释数目也都表现出野生菌多于突变菌。COG数据库差别分析表示氨基酸、核苷酸、辅酶和碳水化合物转运和代谢过程的差异,有可能是导致菌株菌落形态发生变化的原因之一。而次级代谢产物合成和分泌过程相关基因数量的变化,也可能是影响菌株对辣椒白绢病拮抗能力强弱的因素之一。次级代谢产物合成基因簇差异分析,预测得到14个次级代谢产物基因簇,9类基因簇具有抗菌活性,分别为:Plantazolicin、聚酮化合物(difficidin)、丰原素(Fengycin)、多烯类(Bacillaene)、大环内酯抗生素(macrolactin H)、丁胺菌素(butirosin A/butirosinB)、儿茶酚型嗜铁素(Bacillibactin)、杆菌溶素(Bacilysin)和表面活性肽(Surfactin)。还存在5种功能未知的基因簇,说明两菌株中存在合成新抑菌物质的基因簇可能性很大。14个代谢产物基因簇中丰原素(Fengycin)和多烯类(Bacillaene)基因数量的多,这可能就是影响菌株拮抗辣椒白娟病重要因素,为生防菌解淀粉芽孢杆菌更深一步研究提供参考。
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