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目的:研究Q开关激光对豚鼠皮肤黑素细胞的影响,构建白癜风动物模型;建立人骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离培养方法,体外诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞,探讨诱导分化为黑素细胞的体内外微环境。
方法:1、Q开关YAG激光照射豚鼠的黑色皮肤,间隔10天重复照射1次,共3次。通过观察皮肤颜色变化、HE染色和HMB5免疫组化染色后,观察黑素细胞的变化。
2、采用全骨髓贴壁法提取MSCs,进行体外扩增与纯化,通过细胞形态,以及定向诱导MSCs向脂肪细胞、成骨细胞分化,从而证明培养的细胞是具有多向分化潜能的MSCs。
结果:
1、Q开光激光构建白癜风动物模型:(1)Q开关YAG激光第1次照射后10d,观察照射区域黑色皮肤呈白色,可见小黑点,长出的毛发几乎为白色,极少量黑色。照射区域HE染色及HMB5免疫组化染色后,镜下观察基底层偶见黑素细胞。(2)第2次激光后10d和第3次激光后10d(模型建成期),照射区域皮肤呈白色,长出的毛发均为白色。照射区域HE染色及HMB45免疫组化染色后,镜下基底层未见黑素细胞。(3)模型建成后8周,激光照射区域的皮肤及长出的毛发仍呈白色。HE染色及HMB45免疫组化染色后,镜下观察基底层未见黑素细胞。
2、人骨髓MSCs的培养与鉴定:(1)人骨髓MSCs的形态学观察:首次换液后,可见散在椭圆形、梭形、多角形细胞,分布不均匀。随着换液次数的增加,未贴壁的杂细胞逐渐被洗掉,剩下的贴壁紧密的细胞的形态逐渐变成长梭形,可见少量细胞克隆形成,中心细胞分布较密,外周细胞呈放射状向外分布。当细胞传代后,细胞分布均一,呈长梭形,细胞数增加越来越快。(2)人骨髓MSCs向成骨细胞诱导分化:经Von Kossa染色后,可见棕褐色的钙结节。(3)人骨髓MSCs向脂肪细胞诱导:经油红染色后,可见胞浆中橘红色的脂滴。
结论:
1、运用Q开关YAG激光可以破坏豚鼠皮肤的黑素细胞,并且可以维持至少8周的稳定性,从而构建短期稳定的白癜风动物模型,为白癜风的研究提供可依据的动物模型。
2、采用全骨髓贴壁法提取人MSCs,进行体外扩增与纯化,诱导为成骨细胞、脂肪细胞。从人骨髓中提取的具有多向分化能力的MSCs,为下一步研究向黑素细胞的分化奠定基础。