背景“梓葛冻干粉针”为本实验室自主创制的抗脑缺血卒中的中药单体复方新药,由梓醇和葛根素组成,已经申请技术发明专利。课题组前期已经进行了该制剂对大鼠永久性脑缺血后神经功能恢复,对脑梗死面积、脑血管新生和改善气虚血瘀证等方面的研究。但该制剂对脑部微循环是否有影响,尚不确定,有待研究。目的在整体动物与离体细胞实验中,观察梓葛冻干粉针对脑缺血再灌注损伤的保护作用效果,并从调节微血管的舒缩功能、通透性和血液流变性的角度,探讨其对脑微循环保护作用的机制。方法1.梓葛冻干粉针对大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤脑微循环障碍的改善作用取雄性SD大鼠80只,采用随机数字法分为假手术组(10只)、缺血1h再灌注组(20只,造模成功16只)、缺血2h再灌注组(20只,造模成功14只)、缺血4h再灌注组(20只,造模成功8只)和尼莫地平组(缺血2h后再灌注,2.00mg·kg-1,10只,造模成功8只),大鼠再灌注时即刻给药(再灌注0h),尾静脉注射给药,每天1次(10mL·kg-1,体质量),连续给药14d,假手术组和模型组给同等体积的生理盐水。采用大鼠大脑左侧中动脉线栓法(MCAO)复制脑缺血/再灌注(I/R)模型,进行神经行为学评定,分别在缺血1h、2h和4h后再灌注,并于造模后1d、4d、7d、14d对大鼠进行改良神经功能缺损评分(mNSS)。取雄性SD大鼠540只,线栓法复制I/R模型,随机分为假手术组(60只)、模型组(80只,造模成功61只)、葛根素注射液组(30.00mg·kg-1,80只,造模成功68只)、尼莫地平组(2.00mg·kg-1,80只,造模成功69只)、梓葛冻干粉针16.40mg·kg-1(80只,造模成功65只)、32.70mg·kg-1(80只,造模成功68只)和65.40mg·kg-1组(80只,造模成功70只),大鼠再灌注时即刻给药(再灌注0h),尾静脉注射给药,每天1次(10mL·kg-1,体质量),考察时间点分为缺血2h再灌注1d、4d、7d和14d,假手术组和模型组给同等体积的生理盐水。大鼠进行神经功能缺损评分,应用激光多普勒血流量仪测定软脑膜血流量的变化；HE染色光镜下观察大鼠皮层区病理形态学变化和损伤状况；TTC染色测定梗死体积；干湿法测定脑组织含水量；伊文氏蓝(EB)含量测血管的通透性；免疫组化染色法检测CD31表达。取雄性SD大鼠960只,随机分为假手术组(96只)、模型组(144只,造模成功109只)、葛根素注射液组(30.00mg·kg-1,144只,造模成功120只)、尼莫地平组(2.00mg·kg-1,144只,造模成功123只)、梓葛冻干粉针16.40mg·kg-1(144只,造模成功117只)、32.70mg·kg-1(144只,造模成功122只)和65.40mg·kg-1(144只,造模成功126只)组,大鼠再灌注时即刻给药(再灌注0h),尾静脉注射给药,每天1次(10mL·kg-1,体质量),考察时间点分为缺血2h再灌注1d、4d、7d和14d,假手术组和模型组给同等体积的生理盐水。酶免疫试剂盒检测患侧脑皮层微血管中一氧化氮合成酶(NOS)、内皮素(ET-1)、6-酮-前列腺素F1α(6-Ke-to-PGF1α)和血栓素B2(TXB2)的含量；应用荧光定量PCR(qPCR)和免疫印迹(Western blot)检测脑皮层微血管的MMP-9、ZO-1、Occludin及Claudin-5mRNA和蛋白的表达变化。2.梓葛冻干粉针对高分子葡聚糖大鼠脑微循环障碍的改善作用取雄性SD大鼠120只,随机分为正常对照组、模型组、尼莫地平(2.00mg-kg-1)、梓葛冻干粉针16.40ng·kg-1、32.70mg·kg-1和65.40mg·kg1组,每组20只,尾静脉注射给药,每天1次(10mL·kg-1,体质量),连续给药14d后开颅窗,并于末次给药30min后,大鼠(除正常对照组)再经股静脉给予10%高分子葡聚糖T-500(10nL·kg-1)复制大鼠急性脑微循环障碍模型,生物显微镜下观察大鼠造模前5min和造模后1、5、10、20、40、60min时间点软脑膜微动静脉直径,激光多普勒血流仪监测血流量,电阻法测红细胞压积,全自动血液流变仪测流变学指标。3.梓葛冻干粉针对体外缺氧/复氧损伤大鼠脑微血管内皮细胞mmp-9蛋白表达的影响采用氧糖剥夺的方法,建立体外培养大鼠脑微血管内皮细胞的缺氧复氧模型(模拟体内脑缺血再灌注损伤模型)。MTT法检测内皮细胞的增殖。内皮细胞缺糖缺氧2h再复氧24h损伤后,Western blot检测mmp-9蛋白表达。结果1.梓葛冻干粉针对大鼠局灶性脑缺血/再灌注的脑微循环障碍的改善作用(1)大鼠局灶性脑缺血/再灌注模型复制及神经行为学评定脑缺血/再灌注损伤后大鼠神经功能缺损明显,其中损伤后1dmNSS评分1h、2h、4h组分别为5.68±0.75、9.23±1.05、11.53±1.88；14d梗死面积比率分别为0.1026±0.0214、0.2245±0.0228、0.3828±0.0318。缺血1h组主要的梗死部位为皮质,2h、4h组主要梗死部位为皮质及基底节区。确定缺血2h为最佳的造模时间进行后续实验。(2)梓葛冻干粉针对脑缺血／再灌注大鼠脑微循环血流量、梗死体积及脑水肿的影响梓葛冻干粉针(16.40mg·kg-1、32.70mg·kg-1和65.40mg·kg-1)可在再灌注时使脑血流缓慢恢复。TTC染色结果显示,假手术组脑组织均呈深红色未见梗死灶；模型组可见大面积的梗死灶,多位于左侧皮质和基底节区；再灌注14d,与模型组相比,梓葛冻干粉针65.40mg·kg-1组梗死体积显著减少(P<0.05),提示梓葛冻干粉针可减轻大鼠脑缺血/再灌注的损伤。与假手术组相比,模型组大鼠脑组织含水量和EB含量显著升高(P<0.01),显示造模成功。再灌注7d和14d,与模型组相比,梓葛冻干粉针(16.40mg·kg-1、32.70mg·kg-1和65.40mg·kg1)可明显抑制大鼠的病变侧脑组织含水量和EB含量升高(P<0.05,P<0.01),提示其可改善脑缺血/再灌注损伤大鼠的血管通透性。HE染色观察,脑缺血再灌注后大鼠大脑缺血侧细胞层次紊乱,细胞坏死,胞核萎缩成不规则状,水肿,疏松,炎性细胞浸润。而梓葛冻干粉针(16.40mg·kg-1、32.70mg·kg-1和65.40mg·kg1)组在相应考察时间点可减少炎性细胞浸润,减小细胞周围间隙和水肿。(3)梓葛冻干粉针对局灶性脑缺血/再灌注大鼠脑微血管密度的影响免疫组化结果显示,假手术组CD31阳性细胞表达很少。与假手术组相比,模型组再灌注后1d缺血侧大鼠皮层区有少量CD31阳性细胞表达,到4d、7d有较高表达,7d以后阳性细胞表达增多缓慢或基本不增长(P<0.01)。与模型组阳性细胞表达相比,葛根素注射液组(30.00mg·kg-1)、尼莫地平组(2.00ng·kg-1)、梓葛冻干粉针16.40ng·kg-1、32.70mg·kg-1和65.40mg-kg-1组的梗死灶周边区阳性细胞表达,除再灌注后1d的无显著差异外,其余各个时间点的阳性细胞表达均显著增多(P<0.01),提示其可能促进了脑缺血/再灌注损伤大鼠血管新生。(4)梓葛冻干粉针对脑缺血/再灌注大鼠的脑微循环中微血管舒缩功能的影响与假手术组相比,模型组的大鼠缺血侧脑皮质层微血管中总NOS (TNOS)和诱生型NOS (iNOS)活力均显著升高(P<0.01),而原生型NOS (cNOS)活力显著降低(P<0.01),显示造模成功。与模型组相比,再灌注1d,葛根素注射液组(30.00mg·kg1)、尼莫地平组(2.00mg·kg-1)、梓葛冻干粉针16.40mg·kg-1、32.70mg·kg-1和65.40mg·kg-1组均显著降低TNOS和iNOS活力(P<0.05,P<0.01)；再灌注4d、7d和14d,各给药组均能显著降低TNOS、iNOS活力(P<0.01),且也能显著升高cNOS活力(P<0.01),提示梓葛冻干粉针有改善脑缺血/再灌注损伤大鼠微血管舒缩功能的效果。与假手术组相比,模型组的大鼠缺血侧脑皮质层微血管中ET-1含量均升高(P<0.01),且随着观察时间延长而逐渐增多,显示造模成功。再灌注1d,与模型组相比,梓葛冻干粉针32.70mg-kg-1组能显著降低大鼠缺血侧脑皮质层ET-1含量(P<0.05)；再灌注4、7和14d时,与模型组相比,梓葛冻干粉针各剂量组均能极显著降低大鼠缺血侧脑皮质层微血管中ET-1含量(P<0.01),提示其有减轻血管收缩和血管内皮细胞损伤的作用。再灌注1、4、7和14d时,与假手术组相比,模型组的大鼠缺血侧脑皮质层微血管中TXB2含量升高和6-Ke-to-PGF1α含量降低(P<0.01),显示造模成功。而与模型组相比,梓葛冻干粉针16.40mg·kg-1、32.70ng·kg-1和65.40mg·kg-1组能显著抑制大鼠缺血侧脑皮质层TXB2含量升高和6-Ke-to-PGF1α含量降低(P<0.05,P<0.01),且能降低TXB2/6-Ke-to-PGF1比值(P<0.01),提示其有改善脑缺血／再灌注损伤大鼠微血管舒缩功能的效果。(5)梓葛冻干粉针对脑缺血/再灌注大鼠的脑微循环中微血管通透性的影响荧光定量PCR结果显示,假手术组皮层脑组织中有少量MMP-9mRNA表达,脑缺血再灌注后,各时间点(1、4、7和14d),与假手术组相比,模型组的大鼠缺血侧脑皮质层微血管中MMP-9mRNA表达均显著升高(P<0.01),显示造模成功。与模型组相比,梓葛冻干粉针16.40mg·kg-1、32.70mg、kg-1和65.40mg·kg-1组均能显著降低大鼠缺血侧脑皮质层微血管中MMP-9mRNA表达水平(P<0.05,P<0.01)；与假手术组相比,模型组的大鼠缺血侧脑皮质层微血管中Claudin-5mRNA、Occludin mRNA、ZO-1mRNA表达均显著降低,而与模型组相比,梓葛冻干粉针各剂量组在相应时间点能显著增加大鼠缺血侧脑皮质层微血管中Claudin-5mRNA、Occludin mRNA、ZO-1mRNA表达(P<0.05,P<0.01)。Western blot检测蛋白结果与其基因水平结果基本一致。在再灌注1、4、7和14d,与假手术组相比,模型组的大鼠缺血侧脑皮质层微血管中MMP-9蛋白表达均显著升高(P<0.01),显示造模成功。与模型组相比,各给药组均能显著降低大鼠缺血侧脑皮质层微血管中MMP-9蛋白表达(P<0.01)；与假手术组相比,模型组的大鼠缺血侧脑皮质层微血管中Claudin-5、Occludin、ZO-1蛋白水平均显著降低,而与模型组相比,梓葛冻干粉针各剂量组在相应时间点能显著升高大鼠缺血侧脑皮质层微血管中Claudin-5、Occludin、ZO-1蛋白表达水平(P<0.05,P<0.01),提示其有改善脑缺血/再灌注损伤大鼠微血管通透性的效果。2.梓葛冻干粉针对高分子葡聚糖大鼠急性脑微循环障碍的改善作用与正常组相比,在考察相对应的时间点,模型组的大鼠软脑膜微动脉,微静脉内径显著缩小,且血流量呈显著下降(P<0.01),显示造模成功；与模型组相比,梓葛冻干粉针16.40mg·kg-1,32.70mg·kg-1和65.40mg-kg-1组中大鼠软脑膜的微动脉、微静脉内径恢复显著(P<0.01),且能使血流量在10min以后基本恢复至造模前的血流量。与正常组相比,模型组的全血粘度、血浆粘度、红细胞压积和红细胞聚集指数均显著升高,显示造模成功；与模型组相比,梓葛冻干粉针65.40mg·kg-1组能显著降低血液流变学的各项指标(P<0.01)；梓葛冻干粉针16.40mg·kg-1口32.70mg·kg-1组能显著降低除红细胞压积以外的其它项血液流变学的指标(P<0.05,P<0.01),提示梓葛冻干粉针具有对大鼠急性脑微循环障碍的改善作用。3.梓葛冻干粉针对体外缺氧/复氧损伤大鼠脑微血管内皮细胞mmp-9蛋白表达的影响MTT法结果显示,梓葛冻干粉针作用于脑微血管内皮细胞的ICso值为860μg·mL-1。缺氧/复氧损伤下,与正常对照组相比,复氧24h后,模型组的BMECs细胞中MMP-9蛋白表达显著升高(P<0.01),显示造模成功。与模型组相比,梓葛冻干粉针24.50μg·ML-1、49.00μg·mL1和98.00μg·mL-1可抑制BMECs缺氧／复氧损伤下MMP-9蛋白升高,提示其对血管内皮细胞完整性具有保护作用。结论1.采用Longa线栓法制备脑缺血模型最佳的缺血/再灌注时间为缺血2h,模型稳定,可控性和可重复性好。梓葛冻干粉针对脑缺血/再灌注损伤大鼠,能使脑血流在再灌注时缓慢恢复,减小脑梗死体积,减小脑组织含水量和EB含量,可以减轻脑水肿和血脑屏障的破坏程度；梓葛冻干粉针能促进缺血侧大鼠皮层区CD31的表达,表明可促进脑缺血/再灌注损伤大鼠的血管新生；梓葛冻干粉针改善脑微循环可能与调节微血管舒缩功能,抑制iNOS的活化,减少TNOS和ET-1的生成,抑制大鼠缺血侧脑皮质层TXB2和6-Ke-to-PGF1。表达有关；同时,梓葛冻干粉针可抑制MMP-9mRNA及蛋白表达和促进Claudin-5、Occludin、ZO-1mRNA及蛋白表达,保护微血管完整性,降低微血管通透性,改善脑微循环。2.梓葛冻干粉针对急性脑微循环障碍大鼠,可扩张脑微动静脉管径,逆转脑血流量下降的趋势和血液粘稠,提示梓葛冻干粉针具有对急性脑微循环障碍的改善作用。3.梓葛冻干粉针能抑制BMECs缺氧／复氧损伤下MMP-9蛋白表达,提示其对血管内皮细胞完整性的保护作用机制可能与降低MMP-9蛋白表达有关。