随着饮食习惯和生活方式的改变,肥胖的发病率逐年攀升。2008年全世界大约有15亿人超重和肥胖。预计到2030年,超重和肥胖的人数将分别达到21.6亿和11.2亿。肥胖还伴发多种代谢性疾病,包括2型糖尿病、非酒精性脂肪性肝病、动脉粥样硬化等。40%的美国人60岁时患有不同的代谢性疾病；在欧洲至少有四分之一的成年人患有代谢综合征；拉丁美洲的患病率与欧洲接近；而在亚洲国家,代谢综合征的患病率女性是2%-18%,男性是8%-13%。由此可见,世界范围内肥胖和相关代谢性疾病都有广泛流行性,并且造成巨大的医疗负担和经济负担,因此阐明肥胖和相关代谢性疾病的发病机理和病理机制,找出其防治措施是十分必要的。内质网是除红细胞以外所有真核细胞都含有的细胞器,具有多种功能,并且是糖脂代谢的重要场所,内质网应激与免疫系统之间相互影响相互作用,可引起炎性反应和氧化应激等多种应激反应,因此与代谢性疾病的发病有密切联系。此外,内质网还是体内营养素的敏感感受器,内质网应激还受膳食营养素和成分影响。因此,本研究拟运用分别添加了猪油和大豆油的高脂饲料诱导大鼠肥胖发生,观察不同油脂成分高脂饮食诱导的肥胖大鼠胰岛素抵抗和肝脏脂肪变性发生的差异,并从内质网应激、炎性反应及固有免疫系统反应的角度探讨胰岛素抵抗和肝脏脂肪变性的可能病理机制。第一部分不同油脂成分高脂饮食诱导肥胖大鼠胰岛素抵抗和肝脏脂肪变性的差异性研究第一节不同油脂成分高脂饮食诱导大鼠肥胖发生的差异性研究目的用等能的猪油和大豆油的高脂饲料诱导SD大鼠肥胖发生,研究不同油脂成分的高脂饲料诱导大鼠肥胖发生率的差异,以及低脂饲料干预对肥胖大鼠体重和体脂的影响。方法将100只清洁级雄性SD大鼠适应性喂养10天后,按体重随机分为三组：正常对照组(low fat food, LF, n=10),给予基础饲料喂养；猪油高脂实验组(high lard oil food, HL, n=45),给予添加了猪油的高脂饲料喂养；大豆油高脂实验组(high soybean oil food, HS, n=45),给予添加了大豆油的高脂饲料喂养。各组大鼠均自由摄食、饮水,动物房温度(22±5)℃,相对湿度(50±10),明暗周期12h：12h。第10周末,体重大于LF组平均体重加1.96倍标准差的(χ+1.96s)高脂组大鼠判定为饮食诱导肥胖大鼠(dietary induced obesity, DIO)(HL-DIO, HS-DIO),体重小于LF组平均体重加1.96倍标准差的高脂组大鼠不纳入之后的实验。然后再将HL-DIO和HS-DIO随机分别分为两个亚组,一组继续其初始的高脂饲料(HL-DIO-HL, HS-DIO-HS),另一组改以普通低脂饲料喂养(HL-DIO-LF, HS-DIO-LF),对照组饲料不变(LF),喂养8周。实验期间每天定时记录大鼠摄食量,每周定时称体重。第0周、第10周末,大鼠隔夜禁食12小时后采尾血,分离血清,置-80℃冰箱保存待测。第18周末,大鼠隔夜禁食12小时后断头处死,取全血后分离血清,置-80℃冰箱保存待测；分离肾周脂肪、睾周脂肪组织,分别称重后快速液氮冻存,置-80℃冰箱保存待测。结果HL-DIO和HS-DIO组的肥胖发生率分别为42.2%和48.9%,HL和HS的肥胖诱导率无显著差异。HL-DIO和HS-DIO组的体重从第3周丌始到第10周末都显著高于LF组,HL-DIO和HS-DIO组之间,体重始终无显著性差异。从第10周末到18周末,HL-DIO-HL, HL-DIO-LF, HS-DIO-HS, HS-DIO-LF四组的平均体重均显著大于LF组,HL-DIO-HL和HS-DIO-HS组之间,体重始终无显著差异。HL-DIO-LF组体重从第17周起显著低于HL-DIO-HL组,HS-DIO-HS与HS-DIO-LF组体重始终无显著差异。从第1周到第10周,LF组摄食量显著高于HL-DIO和HS-DIO,但HL-DIO和HS-DIO组的10周累积能量摄入显著高于LF。HL-DIO和HS-DIO组之间无显著差异。干预期8周的摄食,从第15周开始,LF, HL-DIO-LF和HS-DIO-LF三组的摄食显著高于HL-DIO-HL和HS-DIO-HS组,8周的累积能量摄入五组之间无显著差异。肾周脂肪加睾周脂肪总湿重的比较,其余四组均显著高于LF组,HS-DIO-HS组低于HL-DIO-HL组,HL-DIO-LF和HS-DIO-LF组均显著低于相应高脂组。脂体重比的比较,HL-DIO-HL, HL-DIO-LF和HS-DIO-HS组显著高于LF组,HL-DIO-LF和HS-DIO-LF组均显著低于相应高脂组。10周末,HL-DIO组血清TG显著高于HS-DIO和LF组,HS-DIO组显著高于LF组,HL-DIO和HS-DIO组血清TC高于LF组,HL-DIO和HS-DIO组之间无显著差异。18周末,其余四组血清TG均显著高于LF组,HL-DIO-HL组显著高于HS-DIO-HS组,HL-DIO-LF显著低于HL-DIO-HL组。HL-DIO-HL和HS-DIO-HS组血清TC均显著高于LF组,HL-DIO-LF和HS-DIO-LF组均显著低于相应高脂组。结论HL和HS具有相似的肥胖诱导作用；虽然猪油和大豆油肥胖组的体重无显著差异,但猪油高脂组大鼠的脂肪蓄积量显著大于大豆油高脂组；猪油和大豆油高脂饮食均具有升高血脂的作用,尤其是猪油高脂饮食,低脂饮食干预可降低大鼠体重、体脂和血脂。第二节不同油脂成分高脂饮食诱导的肥胖大鼠肝脏脂肪变性的差异性研究目的用等能的猪油和大豆油高脂饲料诱导SD大鼠肥胖发生,研究不同油脂成分的高脂饲料诱导的肥胖大鼠肝脏脂肪变性发生的差异,以及低脂饲料干预对肝脏脂肪变性的影响。方法实验动物饲养及分组同第一部分第一节。第0周、第10周末,大鼠隔夜禁食12小时后采尾血,分离血清,置-80℃冰箱保存待测。第18周末,大鼠隔夜禁食12小时后断头处死,取全血后分离血清,置-80℃冰箱保存待测；分离肝脏,称重,取一部分肝脏组织甲醛固定,石蜡包埋,以备制作病理切片,其余组织快速液氮冻存,置-80℃冰箱保存待测。结果18周末各组大鼠肝脏重量无显著差异；肝脏TG含量的比较,HL-DIO-HL和HS-DIO-HS组均显著高于LF组,HL-DIO-HL组显著高于HS-DIO-HS组,HL-DIO-LF和HS-DIO-LF组均显著低于相应高脂组；肝脏病理切片的比较,HL-DIO-HL和HS-DIO-HS组肝脏脂肪变性的发生率均为100%,但脂肪变性的程度不尽相同,HS-DIO-HS组肝脏脂肪变性程度低于HL-DIO-HL组, HL-DIO-LF和HS-DIO-LF组的肝细胞形态已基本接近对照组。结论HL和HS诱导的肥胖大鼠均发生了不同程度的肝脏脂肪变性,HL肥胖组肝脏脂肪变性程度高于HS肥胖组,低脂饮食干预可有效改善肝脏脂肪变性。第三节不同油脂成分高脂饮食诱导的肥胖大鼠胰岛素抵抗的差异性研究目的用等能的猪油和大豆油高脂饲料诱导SD大鼠肥胖发生,研究不同油脂成分的高脂饲料诱导的肥胖大鼠胰岛素抵抗发生的差异,以及低脂饲料干预对胰岛素抵抗的影响。方法动物饲养和分组同第一部分第一节。第0周、第10周末,大鼠隔夜禁食12小时后采尾血,分离血清,置-80℃冰箱保存待测。第18周末,大鼠隔夜禁食12小时后断头处死,取全血后分离血清,置-80℃冰箱保存待测。分离肝脏组织,快速液氮冻存,置-80℃冰箱保存待测。结果HL-DIO-HL, HS-DIO-HS和HS-DIO-LF组18周累积增重大于LF组,HL-DIO-LF组增重小于HL-DIO-HL组；HL-DIO-HL和HS-DIO-HS组18周累积能量摄入大于相应低脂组和LF组；18周末,五组大鼠的空腹血糖无显著差异,HL-DIO-HL组空腹胰岛素和HOMA-IR显著高于HS-DIO-HS和LF组,HL-DIO-LF组显著低于HL-DIO-HL组但仍显著高于LF组,HS-DIO-LF组相较于HS-DIO-HS组无明显差异。结论虽然猪油和大豆油高脂肥胖组的累积增重和累计能量摄入无显著差异,但大豆油肥胖组组胰岛素敏感性显著高于猪油肥胖组,且低脂饮食干预可改善胰岛素敏感性。第二部分不同油脂成分高脂饮食诱导的肥胖大鼠胰岛素抵抗和肝脏脂肪变性差异性的机制研究第一节肝脏内质网应激与饮食诱导肥胖大鼠肝脏脂肪变性的关系及低脂饮食干预影响的研究目的通过检测不同油脂成分高脂饮食诱导的肥胖大鼠肝脏内质网应激相关分子的表达情况,判断各组大鼠肝脏内质网应激的程度,探讨不同油脂成分高脂饮食对肝脏内质网应激的影响及在肝脏脂肪变性发生发展中所起的作用及机制。方法实验动物饲养及分组同第一部分第二节。第18周末,大鼠隔夜禁食12小时后断头处死,分离肝脏组织,快速液氮冻存,置-80℃冰箱保存待测。使用GSH和MDA试剂盒检测各组大鼠肝脏GSH和MDA含量。实时定量PCR法(Real-timePCR)检测各组大鼠肝脏GRP78、CHOP、PPARγ、PPARα及SREBP1c mRNA表达水平；免疫印迹法(Western Blot)检测各组大鼠肝脏组织CHOP蛋白表达。结果HL-DIO-HL和HS-DIO-HS组大鼠肝脏GSH含量均显著低于LF组,两组之间无显著差异,HL-DIO-LF相较于相应高脂组显著上调,HS-DIO-LF组相较于HS-DIO-HS组也有上调,但差异无统计学意义；HL-DIO-HL组肝脏MDA含量显著高于HS-DIO-HS和LF组,HS-DIO-HS和LF组之间无显著差异,HL-DIO-LF和HS-DIO-LF组均相较于相应高脂组显著下调；HL-DIO-HL组肝脏GRP78和CHOP mRNA表达均显著高于HS-DIO-HS和LF组,HL-DIO-LF和HS-DIO-LF组相较于相应高脂组均有显著下调；CHOP蛋白表达的趋势与其mRNA表达相符；肝脏PPARγ mRNA表达的比较,其余四组均显著高于LF组,四组之间无显著性差异；HL-DIO-HL和HL-DIO-LF组大鼠肝脏PPARα mRNA表达均显著高于LF组,HS-DIO-HS和HS-DIO-LF组大鼠肝脏PPARα mRNA表达均显著低于LF组,且低脂饮食干预对肝脏PPARα mRNA表达也无显著影响；HL-DIO-HL和HS-DIO-HS组肝脏SREBP1c mRNA表达均显著高于LF组,两组之间无显著性差异,HL-DIO-LF和HS-DIO-LF组均相较于相应高脂组明显下调。结论猪油肥胖组和大豆油肥胖组大鼠均发生了肝脏脂肪变性,但猪油高脂组肝细胞内质网应激和氧化损伤程度相较于大豆油高脂组更严重,可能与NAFLD发生发展有关。第二节肝脏骨桥蛋白表达与饮食诱导肥胖大鼠胰岛素抵抗的关系及低脂饮食干预影响的研究目的比较HL和HS诱导的肥胖大鼠胰岛素敏感性、肝脏OPN和前炎性因子表达水平的差异,探讨OPN在肥胖个体肝脏炎性反应与胰岛素抵抗发生发展过程中所起的作用。方法实验动物饲养及分组同第一部分第三节。第0周大鼠隔夜禁食12小时后采尾血,分离血清,置-80℃冰箱保存待测。第18周末,大鼠隔夜禁食12小时后断头处死,取全血后分离血清,置-80℃冰箱保存待测。分离肝脏组织,快速液氮冻存,置-80℃冰箱保存待测。运用ELISA试剂盒检测各组大鼠0周和18周末血清OPN的含量；实时定量PCR法(Real-time PCR)检测各组大鼠肝脏OPN和TNF-a mRNA表达水平；免疫印迹法(Western Blot)检测各组大鼠肝脏组织OPN蛋白表达。结果各组大鼠血清OPN含量在实验初始和18周末均无显著差异;HL-DIO-HL组大鼠肝脏OPN mRNA和蛋白表达均显著高于HS-DIO-HS和LF组,HS-DIO-HS组OPN表达与对照组水平相当,无显著差异,HL-DIO-LF组相较于HL-DIO-HL组显著下调,HS-DIO-LF组相较于HS-DIO-HS无明显下调；HL-DIO-HL组肝脏TNF-a mRNA表达显著性高于HS-DIO-HS和LF组,HS-DIO-HS组相较于LF组也显著上调,HL-DIO-LF和HS-DIO-LF组相较于相应高脂组均有显著降低。结论大豆油高脂肥胖组大鼠胰岛素敏感性高于猪油高脂肥胖组,可能与富含多不饱和脂肪酸的大豆油高脂饮食使肝组织OPN表达降低,致使肝组织前炎性因子表达下调有关。第三节固有免疫系统Toll样受体家族与饮食诱导肥胖大鼠肝脏脂肪变性和胰岛素抵抗的关系及低脂饮食干预影响的研究目的比较HL和HS诱导的肥胖大鼠胰岛素敏感性、肝脏脂肪变性和肝脏Toll样受体表达水平的差异,探讨Toll样受体在肥胖个体肝脏炎性反应、胰岛素抵抗和脂肪变性发生发展过程中所起的作用。方法实验动物饲养及分组同第一部分。第0周和10周末,大鼠隔夜禁食12小时后采尾血,分离血清,置-80℃冰箱保存待测。第18周末,大鼠隔夜禁食12小时后断头处死,取全血后分离血清,置-80℃冰箱保存待测。分离肝脏组织,快速液氮冻存,置-80℃冰箱保存待测。实时定量PCR法(Real-time PCR)检测各组大鼠肝脏TLR2、TLR4、GRP78、CHOP和TNF-a mRNA表达水平。结果HL-DIO-HL组大鼠肝脏TLR2mRNA表达显著高于HS-DIO-HS和LF组,HS-DIO-HS和LF组之间比较,差异无统计学意义,HL-DIO-LF组相较于相应高脂组TLR2mRNA表达显著下调,HS-DIO-LF组相较于相应高脂组下调不显著；HL-DIO-HL组大鼠肝脏TLR4mRNA表达显著高于HS-DIO-HS和LF组,HS-DIO-HS肝脏TLR4mRNA表达水平与LF组相当,HL-DIO-LF和HS-DIO-LF组相较于相应高脂组均下调显著。GRP78、CHOP和TNF-a mRNA表达水平同第二部分第一节。结论富含饱和脂肪酸的猪油高脂饲料可诱导大鼠肝脏TLRs高表达,引起TLRs通路下游炎性因子高表达,免疫系统与胰岛素抵抗和肝脏脂肪变性等代谢性疾病的发生发展密切相关。第三部分高脂饮食诱导的不同肥胖易感性大鼠肝脏内质网应激的差异性研究第一节肥胖易感和肥胖抵抗动物模型的建立目的建立肥胖和肥胖抵抗动物模型,观察二者体重、摄食、血脂水平和胰岛素敏感性的差异,为之后的研究提供可靠的实验动物。方法清洁级雄性SD大鼠55只,体重120-130g,适应性喂养10天后,按体重随机分为两组,对照组(LF,10只),给予基础饲料喂养；高脂实验组(HF,45只),给予添加了猪油的高脂饲料喂养。10周后,高脂实验组中体重大于对照组平均体重加1.96倍标准差的(χ+1.96s)判定为饮食诱导肥胖(DIO)大鼠,体重小于对照组平均体重加1倍标准差的(χ+s)判定为饮食诱导肥胖抵抗(DIO-R)大鼠。体重介于大于对照组平均体重1倍标准差和小于1.96倍标准差的大鼠,不纳入本次研究。实验期间每天定时记录大鼠摄食量,每周定时称体重。第0周、第10周末,大鼠隔夜禁食12小时后,采尾血,分离血清,置-80℃冰箱保存待测。结果高脂实验组饮食诱导肥胖和肥胖抵抗的发生率分别是42.2%和26.6%,从第3周起到第10周末,DIO组大鼠体重显著高于DIO-R和LF组,DIO-R和LF组之间比较,差异始终无统计学意义；DIO组10周累积增重也显著高于DIO-R和LF组,DIO-R和LF组之间无显著差异；LF组大鼠从第1周起到第10周末,摄食量均显著高于DIO和DIO-R组,DIO-R组大鼠从第2周起一直到第10周末,每周摄食量均显著低于DIO组大鼠；LF组大鼠10周累积摄食量显著高于D10和DIO-R组,而DIO-R组大鼠的累积摄食量又显著低于DIO组。虽然LF组大鼠的累积摄食量显著大于DIO组和DIO-R组,但由于食物能量密度的差异,累积能量摄入量反而是DIO组显著高于LF组和DIO-R组,DIO组和LF组的累积能量摄入量无显著性差异；各组之间血脂水平的比较,DIO组大鼠血清TG水平显著高于DIO-R和LF组,DIO-R组和LF组之间差异无统计学意义,而血清TC水平,则是DIO和DIO-R组均较LF组有显著提高,但DIO-R组仍显著低于DIO组,各组之间血清HDL-C水平均无显著性差异；DIO组大鼠空腹血糖、血胰岛素和HOMA-IR水平均显著高于DIO-R和LF组,DIO-R组虽显著低于DIO组,但仍然显著高于LF组。结论饮食诱导肥胖抵抗大鼠体重、增重、摄食量、累积能量摄入量、血脂水平和胰岛素抵抗程度均显著低于饮食诱导肥胖易感大鼠。第二节肥胖易感和肥胖抵抗大鼠肝脏内质网应激的差异性研究目的比较肥胖易感和肥胖抵抗大鼠肝脏内质网应激程度的差异方法实验动物饲养及分组同第三部分第一节。动物模型建立后,每组继续以原饲料喂养大鼠8周。18周末,大鼠隔夜禁食12小时后断头处死,取肝脏组织,快速液氮冻存,置-80℃冰箱保存待测。结果DIO和DIO-R组肝脏GSH含量显著低于LF组,DIO-R组相较于DIO组有升高趋势,但差异无统计学意义；DIO组肝脏MDA含量显著高于DIO-R和LF组,DIO-R和LF组之间无显著性差异；DIO组肝脏GRP78和CHOP mRNA表达均显著高于DIO-R和LF组,DIO-R和LF组之间无显著性差异；DIO组肝脏TNF-α mRNA表达均显著高于DIO-R和LF组,但DIO-R组亦显著高于LF组。结论肥胖易感大鼠比肥胖抵抗大鼠肝脏内质网应激和氧化损伤程度更严重。