猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae, APP)引起的一种高度传染性呼吸道疾病,给世界各地的养猪业造成了巨大的经济损失。APP通过飞沫传播或感染动物接触传播,定植于猪下呼吸道表皮细胞。APP血清型众多,根据表面多糖抗原性差异可将该病原分为15个血清型。胸膜肺炎放线杆菌在不同国家和地区的流行情况具有一定差异,我国已分离到APP血清1、2、3、4、5、7和8型菌株,其中以7型最多,其次为1型、2型和3型。APP致病过程涉及众多毒力因子,目前围绕其致病机制开展了大量研究工作,然而APP早期定植感染的致病机理尚不明确。Ⅳ型菌毛在多种病原菌致病过程中发挥重要作用,其中包括介导粘附定植、突破免疫屏障、影响生物被膜形成、颤搐运动、DNA摄取等。为了更好地控制和预防APP导致的疾病,研究APP致病机理,尤其是APP早期粘附定植的作用机制具有重要意义。本课题对APPⅣ型菌毛的功能和在致病过程发挥的作用进行探讨,并对Ⅳ型菌毛结构蛋白白ApfA的免疫原性与免疫保护力进行了研究。1.胸膜肺炎放线杆菌Ⅳ型菌毛介导粘附和定植粘附是细菌建立感染的第一步,在致病过程中起着决定性作用。因此本课题对APPⅣ型菌毛是否参与APP宿主粘附定植过程进行研究,研究结果如下：首先,通过荧光定量PCR的方法对APP与猪肺上皮细胞(SJPLC)互作后Ⅳ型菌毛操纵子基因表达水平进行检测,发现与细胞互作后apf操纵子整体表达水平显著上升。其次,本研究构建了Ⅳ型菌毛结构蛋白基因缺失突变株4074△apfA,以及互补菌株C40740△apfA。以猪髋动脉内皮细胞(PIEC)和SJPLC为粘附模型,通过粘附和粘附抑制实验共同证明Ⅳ型菌毛在APP粘附宿主细胞的过程中发挥作用。同时,通过共聚焦显微镜对粘附结果进行观察,发现4074ΔapfA基因缺失突变株粘附能力显著减弱,而互补菌株与野生株粘附能力相当,再次证明Ⅳ型菌毛参与粘附过程。最后,在小鼠活体感染模型中证明Ⅳ型菌毛在APP肺部定植过程中发挥重要作用,并影响APP致病力。以上结果表明APPⅣ型菌毛是细胞接触诱导表达型,参与了APP定植感染过程,在致病过程中发挥重要作用。2.胸膜肺炎放线杆菌Ⅳ型菌毛负调控生物被膜的形成Ⅳ型菌毛参与粘附外的多种致病机制,本研究对APPⅣ型菌毛可能参与的其他致病机制进行探讨。为了研究Ⅳ型菌毛是否与APP生物被膜形成调控相关,我们通过结晶紫染色方法对野生菌株和4074ΔapfA基因缺失突变株的生物被膜形成能力进行定量比较,结果发现4074ΔapfA基因缺失突变株生物被膜形成能力显著增强。该结果表明Ⅳ型菌毛负调控APP生物被膜的形成,我们推测Ⅳ型菌毛可能参与了群体感应调节因子LuxS对于生物被膜形成的负调控过程。此外,我们还对比了野生菌株和4074ΔapfA基因缺失突变株溶血活性和细胞毒性的差异,结果发现Ⅳ型菌毛的缺失不影响APP溶血毒素和细胞毒素的分泌。3.胸膜肺炎放线杆菌Ⅳ型菌毛潜在受体的寻找以上研究证明了Ⅳ型菌毛主要是通过介导细胞粘附在APP早期感染过程中发挥重要作用。在奈瑟球菌属中,Ⅳ型菌毛的已知细胞粘附受体是CD46分子,为了验证CD46分子是否为APP Ⅳ型菌毛的特异性受体,我们进行了以下研究：首先,构建pcDNA-CD46真核表达质粒并转染幼仓鼠肾传代细胞(BHK)(CD46分子阴性细胞),通过流式细胞术检测转染效率,证明CD46分子在BHK细胞中表达。通过粘附实验发现,CD46分子的表达并没有显著提高APP对细胞的粘附效率。其次,用CD46抗体处理SJPLC和PIEC细胞(CD46分子阳性细胞),进行粘附抑制实验,结果显示CD46分子抗体封闭不影响APP对细胞的粘附作用。因此,上述结果证明CD46并非APP特异性粘附受体。为了进一步寻找Ⅳ型菌毛的可能性受体,我们通过酵母双杂交的方法来进行研究：构建pGBKT7-apfA作为诱饵载体,转化酵母Y187菌株后与猪肺部cDNA酵母文库进行杂交,经过三轮筛选获得4个阳性克隆。对阳性克隆进行测序并分析,结果发现其中一个可能是Ⅳ型菌毛互作受体蛋白。该蛋白与猪Talinl蛋白同源,是一种细胞骨架蛋白,其与APPIV型菌毛的互作关系还有待进一步的验证。4.胸膜肺炎放线杆菌Ⅳ型菌毛结构蛋白ApfA是良好的保护性抗原本研究对Ⅳ型菌毛基因簇在APP13个血清型中的分布情况和同源性进行比较分析,结果发现编码ap/A基因的结构蛋白在12个血清型中高度保守；Ⅳ型菌毛基因簇在11个血清型中高度保守。为了检测Ⅳ型菌毛结构蛋白ApfA的免疫原性,我们首先表达纯化了重组ApfA (rApfA)蛋白,然后用纯化的rApfA免疫小鼠,发现能够诱发小鼠产生免疫应答,产生较高抗体水平。其次,我们用rApfA-ELISA对猪APP感染血清和阴性血清中anti-ApfA抗体水平进行检测,发现感染血清中的抗体水平显著高于阴性血清。以上结果说明Ⅳ型菌毛结构蛋白ApfA不仅存在于所有血清型中,序列高度保守,并且具有很强的免疫原性。以上研究发现APP IV型菌毛结构蛋白ApfA具有较好的免疫原性并且高度保守,有可能发展成为是良好的保护性抗原。因此,我们接下来对菌毛结构蛋白ApfA能否提供有效的免疫保护力进行评估。首先,通过rApfA主动免疫小鼠后感染致死剂量APP,发现该抗原能够对APP血清1型4074菌株感染提供90%的保护,对APP血清7型WF83菌株感染提供80%的保护。其次,对免疫血清中anti-rApfA抗体进行分型,发现rApfA能够诱导Th2型主导的免疫反应。用rApfA免疫血清通过静脉注射被动免疫小鼠,发现该免疫血清能够对APP血清1型4074菌株感染提供40%的保护,对APP血清7型WF83菌株感染提供60%的保护。以上结果表明Ⅳ型菌毛结构蛋白ApfA不仅是一种高效的保护性抗原,能够激发小鼠产生Th2型为主导的免疫应答,对于中国流行血清型1型和7型APP感染提供有效保护,而且ApfA诱导的抗体也具有被动免疫保护力,对于APP不同血清型的感染能够提供一定保护。