哺乳动物的性别控制技术,即通过生物学技术干预动物的生殖活动,使动物生产出符合人类所需性别的后代,在畜牧生产中具有巨大的经济价值,一直是畜牧生产中的研究热点。诸多性别控制方法中在精卵结合前进行X精子和Y精子的分离技术具有显著的优势,其生物学基础是X精子和Y精子在精子密度、耐酸碱性、运动性、表面膜电荷含量、DNA含量、膜表面蛋白等存在差异。目前,所有的分离技术中只有流式细胞仪分离精子技术分离效率达到90%以上,在许多动物上已经取得了成功,并且已经应用于商业化生产。但是,该方法存在分离速度较慢、生产成本过高、分离过程对精子有损伤等诸多问题。由此,本研究首先通过优化性别控制分离精子冷冻保存液的配方,提高解冻后性别控制精子质量,降低分离精液的使用成本；其次,制备精子性别特异抗体,为研究一种高效、便捷、经济、低损伤的免疫学分离精子技术提供技术支持；再次,分离、鉴定精子性别相关蛋白,为研究X和Y精子细胞减数分裂后基因表达、物质传递机制及受精前性别控制机制,提供理论和技术支持。第一部分,在精液冷冻保存稀释液中添加猪精清对解冻后性控精子质量的影响。在性别控制精子冷冻保存稀释液中添加一定比例的猪精清,检测用该稀释液冻存的牛性控精子解冻后的质量变化。将分别添加0%、5%、10%、15%及20%猪精清的冷冻保存稀释液用于冷冻保存流式细胞仪分离的牛性别控制精子,随后检测解冻后精子活力、活率、顶体完整率及畸形精子率,发现用含10%、15%及20%猪精清冷冻保存稀释液冻存的精子顶体完整率显著高于不含猪精清冷冻保存稀释液冻存的精子顶体完整率(p<0.05),特别是含15%猪精清的稀释液,保护精子顶体效果最好,比对照提高了51%,证明猪精清对精子顶体完整性具有很好的保护作用。然而,在精子冷冻保存稀释液中添加猪精清对精子解冻后的其他质量性状影响不大。第二部分,精子性别特异蛋白的分离和鉴定。本部分试图通过一系列的免疫学技术检测、分离牛精子上的性别特异蛋白。用流式细胞仪分离的X精子及Y精子分别免疫家兔,制备抗X精子和抗Y精子的兔血清；取过量的Y精子免疫吸附抗X精子血清中的非特异抗体,获得纯化后的抗X精子血清,采用同种方法获得纯化后的抗Y精子血清。将这两种纯化后的血清对未分离的精子、分离的X精子及Y精子进行细胞免疫荧光染色,经流式细胞仪检测,纯化抗X精子血清能结合29.2%的未分离精子、19.7%的X精子和3.9%的Y精子,而纯化抗Y精子血清能结合3.0%的未分离精子、2.2%的X精子及4.2%的Y精子。由此可见,纯化抗X精子血清能选择性结合X精子,而纯化抗Y精子血清未发现此现象。因此,抗X精子血清中可能存在精子性别特异抗体。随后,利用纯化抗X精子和抗Y精子血清分别免疫沉淀牛精子全蛋白中的特异蛋白,将获得的抗原抗体复合物经丙烯酰胺凝胶分离后,发现只有抗X精子血清能捕获一个30kDa左右的蛋白。切取丙烯酰胺凝胶上30kDa条带,对该蛋白进行MS-MS分析测定,根据获得肽指纹图谱,在NCBI Bovidae库中共检索到39个候选蛋白。其中,由X染色体基因表达的蛋白为AKAP4, ANT-3, OCRL和ANXA2。只有AKAP4在减数分裂后的精子中特异表达,而ANT-3、ANXA2和ORCL在体细胞中广泛表达。第三部分,精子性别特异候选蛋白的验证。对精子性别特异候选蛋白AKAP4进行免疫学鉴定。首先采用RT-PCR的方法,以牛睾丸为材料,获得牛的AKAP4基因的全长cDNA序列,并将其克隆到pMD-18T上；经过酶切及序列测定后,进一步克隆到pGEX-KG上。构建成功的重组质粒pKG-AKAP4被转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中大量表达,获得约90kDa大小带GST标签的AKAP4蛋白。随后将带有标签的AKAP4蛋白经GST免疫亲和层析柱纯化,以用于免疫家兔,制备抗AKAP4的血清。随后采用免疫印迹技术测检AKAP4在X精子及Y精子中表达的差异性,结果显示在X精子和Y精子蛋白中均能检测到AKAP4,由此推断AKAP4为精子性别特异蛋白的可能性较小,其可能与精子的其它功能有关,需要对在精子减数分裂后表达的其他候选蛋白进行鉴定。