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虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)自1982年从日本引进以后,大大推动了中国北方养殖业的发展,已经成为我国重要的养殖贝类之一。近几年来,由于大规模细菌性疾病的爆发,扇贝死亡率逐年升高,导致了大量的经济损失。为了给扇贝养殖业的健康发展提供帮助,其重要潜在抗病基因和抗逆基因的鉴定显得愈发重要。固有免疫系统是大多数物种应对各种感染时所采取基本防御策略中的第一道防线,在物种生存和生命延续中起着至关重要的作用。作为免疫防御机制启动的关键步骤,能够激活下游免疫相关基因的TLR信号通路(Toll-like receptor signaling pathway)自然成为了一个研究热点。1.虾夷扇贝NF-kB家族基因鉴定及表达分析NF-κB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)家族基因进化保守并参与多种生理学过程,在脊椎动物和无脊椎动物中得到了广泛的研究。然而,其在双壳类动物中并没有进行系统的鉴定。本论文从虾夷扇贝中鉴定出了两个NF-κB家族基因：PyNF-κB和PyRel。PyNF-KB基因由长度为54bp至774bp的21个外显子组成,其开放读码框(open reading frame)为3465bp,编码1154个氨基酸；PyRel基因由长度为72bp至660bp的12个外显子组成,其开放读码框为1920bp,编码639个氨基酸。蛋白结构分析和系统发生分析用来证实其身份和进化地位。PyNF-KB蛋白序列的二级结构拥有43个α螺旋、76个β折叠片、94个卷曲螺旋和90个转角；PyRel蛋白序列的二级结构拥有16个α螺旋、41个β折叠片、56个卷曲螺旋和54个转角。PyNF-KB和PyRel与其它软体动物Rel/NF-KB蛋白拥有较高的相似度,包括进化保守的1个RHD功能域(Relhomology domain)和1个IPT功能域(Ig-like, plexins, transcription factor domain),还有两个保守的模块。此外,PyNF-KB拥有1个DEATH功能域(death domain)和6个ANK功能域(ankyrin domain),但TAD功能域(transcription activation domain)并没有在PyRel蛋白中预测到。所有Rel/NF-KB蛋白分成两大进化支,相较于脊椎动物Rel/NF-KB而言,PyNF-KB和PyRel在结构上进化保守,但和其它无脊椎动物一样没有旁系同源。为了进一步探索虾夷扇贝NF-κB家族基因的作用,利用Real-time qRT-PCR对虾夷扇贝在不同发育时期、健康成体组织和受到藤黄微球菌、鳗弧菌侵染后不同时间点(3,6,12和24h)血细胞的表达模式进行了分析。结果表明,PyNF-KB前四个时期的表达水平显著高于其它时期,包括卵母细胞、受精卵、多细胞期、囊胚期；PyRel则在原肠胚期、担轮幼虫期和D型幼虫期的表达水平较高。在成体组织中,PyNF-KB和PyRel普遍表达,并在免疫相关组织中高表达。受到藤黄微球菌和鳗弧菌侵染后,PyNF-KB和PyRel在3h时都显著上升,PyNF-KB更加剧烈的波动变化暗示了在对抗革兰氏阴性细菌侵染时,虾夷扇贝可能存在IMD补偿信号通路(immune deficiency signaling pathway)。这个复杂的表达模式表明了PyNF-KB和PyRel在免疫响应中具有特异和协同作用。2.虾夷扇贝Tollip基因鉴定及表达分析Tollip (Toll-interacting protein)是TLR介导固有免疫反应中的一个关键调控因子,但其在贝类动物中并没有进行系统的鉴定。本论文鉴定了PyTollip,并进行了蛋白结构分析和系统发生分析。PyTollip基因由6个内含子和7个外显子组成；其cDNA全长为3815bp,拥有一个73bp的5’UTR, 一个2875bp的3’UTR和一个867bp编码288个氨基酸的开放读码框。其蛋白序列的二级结构拥有11个α螺旋、20个β折叠片、30个卷曲螺旋和27个转角。根据蛋白多序列比对结果,PyTollip与人、鼠和紫贻贝的一致性分别为50%、49%和64%。相较于其它脊椎动物和无脊椎动物Tollip而言,除了在C2功能域(central conserved 2 domain)中发现了一个明显的残基替换(N150), PyTollip在序列和结构特征上都高度保守,其65-162位氨基酸区域为C2功能域,244-286位氨基酸区域为CUE功能域(coupling of ubiquitin to endoplasmic reticulum degradation domain)。对PyTollip的表达分析是在虾夷扇贝的不同发育时期、健康成体组织和受到藤黄微球菌、鳗弧菌侵染后不同时间点(3,6,12和24h)的血细胞中进行的。Real-time qRT-PCR结果表明,受到藤黄微球菌和鳗弧菌侵染后,PyTollip在3h时都显著上升。而受到鳗弧菌侵染24h时,PyTollip的表达量又出现了一个显著的升高。这一现象为Tollip和TLR信号通路在扇贝受到不同细菌病原体侵染后的免疫响应机制提供了新的思路。