抑郁症(Depression)是最常见精神疾病,据中国心理卫生协会的有关统计,我国抑郁症发病率约为3%~5%,目前已经有超过2600万人患何抑郁症,造成经济负担约为621.91亿元,严重影响了患者的生活质量。抑郁症患者的病理特征其他神经精神类疾病不同,其脑内未出观显著的神经元丢失[1]。抑郁症患者尸检结果显示,额叶皮层、海马的体积显著缩小、重量显著减轻,星形胶质细胞数量减少、密度显著降低、其标记物胶质纤维酸性蛋白(Glial firillary acidic protein,GFAP)和 S100 钙结合蛋白 β(S100β)的 mRNA水平和蛋白及达亦显著调[2],同时抑郁症患者多个脑区出现广泛的神经炎症反应,肿肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor,TNF-α).白介素家族成员(Interleukin-l,IL-1、lnterleukin-6,IL-6)和前列腺素(Prostaglandin E2,PGE2)等致炎因子水平显著升高[3]。此外,抑郁症动物模型屮,相关脑区GFAP表达下调，阳性细胞数亦减少[4]。因此,抑郁症足一炎以星形胶质细胞病理改变及功能陣碍为主要特征.伴随神经炎症的神经精神类疾病。寻找理想的干预靶标,抑制星形胶质细胞丢失恢复其正常功能,抑制炎症过度激活有望成为抑郁症治疗和药物研发的新方向和新策略。Figure 1.The NLRP3 inflammasome cascade following stimulation by infectious agents,metabolic or stress signals[5].When the body is stimulated by the DAMP PAMP.these damage factors will cause excessive release of inflammatory factors from peripheral mononuclear cells.increased blood-brain permeability in the inflammatory environment.and excessive inflammation in the brain.Inflammatory factors affect monoamine metabolism.glutamate metabolism and toxicity.synaptic plasticity.and excitability of H PA axis.基础研究和临床证据表明,神经炎症在抑郁症的发生发展中发挥着不可忽视的作用[6-8]。当机体受到外界刺激时,外周单核细胞的炎症因子过度释放,炎性环境下血脑屏障通透性增加,外周炎症因子进入脑内,产生过度的炎症反应。此外,外周炎症因子、趋化因子及色氨酸代谢产物也可激活脑内胶质细胞,引发神经炎症。炎症因子对单胺类神经递质的代谢、谷氨酸的代谢及毒性、突触可塑性、下丘脑-垂体-肾上腺轴(Hypothalamic pituitary adrenal axis,HPA)的兴奋性均产生影响[9.10](如Figure 1)。因此,抑制神经炎症可能具有显著的抗抑郁作用。细胞焦亡(Pyroptosis)是近年发现的,一类炎性半胱天冬酶-1/11/4/5(Cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspasel/11/4/5)介导的程序性细胞死亡方式,其特征为gasdermin D(GSDMD)剪切并伴有大量促炎症因子的释放[11-14]。细胞焦亡的形态学特征、发生及调控机制等不同于凋亡、坏死等其他细胞死亡方式[15.16]。细胞焦亡的发生与NOD样受体蛋白(NOD like receptor protein,NLRP)为核心的炎症小体密切相关:活化的炎症小体切割pro-Caspasel使之成为成熟的Caspasel,具有活性的Caspasel切割GSDMD进而引起细胞焦亡[17]。随着研究深入,非经典的焦亡发生机制逐渐被报道:邵峰教授课题组发现细胞线粒体受损释放细胞色素C(Cytochrome C,Cyto-C)激活Caspase3,剪切gasdermin E(GSDME)触发焦亡[18]。此外,TNF-α与其受体结合激活Caspase8,剪切GSDMD也可触发焦亡[19]。201 8年细胞死亡命名委员会(Nomenclature committee on cell death,NCCD)将焦亡修正为:一种依赖于gasdermin家族蛋白形成质膜膜孔的可调控的细胞死亡(Regulated cell1death),经常但并不总因炎症性Caspase的活化而完成[20]。犬尿氨酸(Kynurenine,KYN)是色氨酸(Tryptophan,Try)代谢的中间产物。约5%的色氨酸在肠道嗜铬细胞中合成5-羟色胺(Serotonin,5-HT),另外大部分色氨酸在外周组织(如肝、肾)和中枢神经系统(如星形胶质细胞、小胶质细胞)被吲哚胺2,3-双加氧酶(Indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)的作用,代谢生成犬尿氨酸。目前认为犬尿氨酸生成增多、5-HT生成减少是抑郁症发病的重要原因之一[21-23]。长期应激引起IDO酶激活,促使色氨酸转化为犬尿氨酸,引起色氨酸总量减少,5-HT生成不足,对杏仁核抑制作用减弱,致使皮质醇(Cortisol,CORT)产生增多,从而导致抑郁症[24]。应激状态下促炎因子、干扰素、氧自由基等的释放也能促使色氨酸转向犬尿氨酸代谢途径,进而影响5-HT合成[24]。研究显示,给予正常小鼠犬尿氨酸时,其表现出抑郁行为,而在受过良好锻炼的小鼠肌肉中,犬尿氨酸能迅速转化为犬尿酸,引发了一种保护机制,因此这些动物不容易抑郁[25]。综上所述,犬尿氨酸在抑郁症中发挥了重要作用。然而,犬尿氨酸对星形胶质细胞炎症的调节以及对抑郁症的发生发展尚不明确。五羟色胺再摄取抑制剂(Selective serotonin reuptake inhibitors,SSRIs)的经典代表药物氟西汀(Fluoxetine,FLX)最初用于增加细胞间隙5-HT浓度,从而治疗抑郁症。随着研究进展发现FLX也可通过五羟色胺受体(5-HT receptor,5-HTR)发挥抗抑郁作用,且研究进一步表明FLX通过星形胶质细胞5-HT2BR发挥抗抑郁作用。5-HT2BR是一类G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptors,GPCR),可通过经典的G蛋白信号通路,调节下游分子信号。近年来研究表明,β-抑制蛋白(β-arrestin)介导的非经典通路在GPCR介导的信号通路中也发挥重要作用。第一部分:在前期研究的基础上,应用慢性温和应激(Chronic mild stress,CMS)模型小鼠验证星形胶质细胞焦亡与抑郁症的相关性。通过免疫荧光、Western blotting、多重染色等方法研究CMS模型小鼠海马区星形胶质细胞死亡形式。结果表明,海马区星形胶质细胞丢失主要以焦亡为主,CMS四周星形胶质细胞焦亡占死亡细胞数的56.7%。运用Caspasel敲除鼠及GSDMD敲除鼠制备CMS模型,行为学结果显示Caspasel或GSDMD敲除缓解CMS小鼠抑郁样行为,表明抑制星形胶质细胞焦亡可缓解CMS小鼠抑郁样行为。此外,在GSDMD-/-小鼠海马脑区过表达含GFAP启动子的GSDMD-N腺相关病毒(Adenovirus associated virus,AAV),四周后制备CMS模型,进一步确认星形胶质细胞GSDMD介导的焦亡参与了抑郁症的发生发展。以上结果表明CMS小鼠海马区星形胶质细胞发生焦亡,抑制星形胶质细胞焦亡缓解小鼠抑郁样行为,GSDMD介导的星形胶质细胞焦亡则加重小鼠抑郁样行为。第二部分:基于第一部分结果,CMS模型小鼠海马组织匀浆及外周血L-KYN水平显著增加,研究L-KYN是否通过NLRP2炎症小体诱导小鼠抑郁样行为。首先离体培养原代星形胶质细胞,给予L-KYN刺激,发现L-KYN+三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)可诱导星形胶质细胞发生焦亡,其机制为:L-KYN促进核因子-κB(NF-kappa B,NF-κB,p65)入核上调NLRP2的表达。在体研究结果表明,腹腔注射L-KYN即可诱导小鼠抑郁样行为,并显著上调小鼠海马脑区NLRP2炎症小体的表达,激活Caspasel及IL-1β成熟体表达量显著增加,表明L-KYN通过激活炎症小体,诱导小鼠海马脑区神经细胞发生焦亡。随后运用腺相关病毒敲低小鼠海马脑区星形胶质细胞NLRP2表达,发现星形胶质细胞特异性敲低NLRP2可显著改善腹腔注射L-KYN所致的小鼠抑郁样行为、减少小鼠海马脑区Caspasel激活及IL-1β的表达。以上结果表明L-KYN+ATP激活NLRP2诱导星形胶质细胞焦亡,参与抑郁症的发生;敲低星形胶质细胞NLRP2能够改善L-KYN诱导的小鼠抑郁样行为。第三部分:基于第一部分发现FLX可以抑制星形胶质细胞焦亡的现象,研究SSRls调控抑郁症中星形胶质细胞焦亡的机制。本部分工作应用β-arrestin2敲除小鼠建立CMS模型,发现β-arrestin2-/-取消FLX缓解小鼠抑郁样行为及抑制CMS小鼠海马脑区Caspasel、GSDMD-N、IL-1β表达量上调的作用,表明β-arrestin2是SSRIs发挥抗抑郁作用的主要靶点。离体培养β-arrestin2+/+和β-arrestin2-/-原代星形胶质细胞,发现5-HT2BR抑制剂SR127445取消SSRIs抑制L-KYN+ATP诱导星形胶质细胞焦亡的作用。进一步探究结果表明,SSRIs促进β-arrestin2与NLRP2炎症小体结合,抑制NLRP2炎症小体活化。由此证明FLX等SSRIs通过5-HT2BR,促进β-arrestin2与NLRP2结合,抑制NLRP2炎症小体介导的星形胶质细胞焦亡,发挥抗抑郁作用。为研发靶向焦亡治疗抑郁症的药物提供了新的分子靶标。第一部分星形胶质细胞焦亡与抑郁症发生的相关性目的;研究星形胶质细胞焦亡在抑郁症发生发展中的作用。方法:采用WT(Wild type,WT)、Caspasel-/-、GSDMD-/-、星形胶质细胞过表达GSDMD-N的GSDMD-/-等多种模式小鼠制备CMS模型,通过行为学、免疫组化、Western blotting、多重染色等多种方法研究焦亡在抑郁症中的作用及机制。结果:1)CMS两周小鼠海马脑区星形胶质细胞活化但未发生焦亡;2)CMS四周小鼠海马脑区星形胶质细胞发生焦亡;3)CMS六周小鼠海马脑区星形胶质细胞焦亡比四周更多;4)CMS六周小鼠海马脑区小胶质细胞及神经元不发生焦亡;5)CMS两周、CMS四周、CMS六周小鼠海马脑区Caspasel、IL-1β表达量,随着造模时间的延长也显著增加;6)FLX可改善CMS小鼠抑郁样行为;7)CMS小鼠海马区星形胶质细胞焦亡,FLX改善星形胶质细胞焦亡;8)FLX降低CMS小鼠海马脑区焦亡相关蛋白表达;9)Caspasel敲除显著增加CMS小鼠糖水偏好及旷场运动总路线,减少强迫游泳及悬尾不动时间;6)Caspasel敲除减轻CMS小鼠海马脑区星形胶质细胞焦亡;7)GSDMD敲除显著增加CMS小鼠糖水偏好及旷场运动总路线,减少强迫游泳及悬尾不动时间;8)GSDMD敲除缓解CMS小鼠海马区星形胶质细胞焦亡;9)GSDMD敲除小鼠海马星形胶质细胞特异性过表达GSDMD-N,恢复GSDMD敲除CMS小鼠抑郁样行为。结论:1)CMS小鼠海马区星形胶质细胞发生焦亡;2)GSDMD介导的星形胶质细胞焦亡参与抑郁的发生发展。第二部分犬尿氨酸通过NLRP2炎症小体调节星形胶质细胞焦亡的分子机制目的:阐明犬尿氨酸通过NLRP2炎症小体调节星形胶质细胞焦亡的分子机制。方法:通过高效液相(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)检测CMS小鼠海马组织匀浆及外周血清的犬尿氨酸水平。Western blotting、YO-pro-1 iodid/EthD2双染研究L-KYN+ATP对于星形胶质细胞焦亡的影响。体外培养WT原代星形胶质细胞给予不同浓度L-KYN(0μM、62.5 μM、125μM、500 μM、1mM、2 mM)刺激,检测NLRP2、NLRP3表达水平。siRNA敲低星形胶质细胞NLRP2或NLRP3表达,再给予L-KYN+ATP刺激,Western blotting检测Caspasel、GSDMD、IL-1p表达水平,YO-pro-1 iodid/EthD2双染观察阳性细胞数。siRNA敲低星形胶质细胞AhR表达,再给予L-KYN+ATP刺激,Western blotting检测NLRP2表达水平,Chip检测NLRP2与AhR结合情况。Western blotting检测p65、p-p65、IκB激酶β(IκBkinase-β,IKKβ)、p-IKKβ蛋白表达水平。采用胞浆胞核分离试剂盒检测p65胞浆胞核的分布。Western blotting及免疫荧光检测NF-κB抑制剂JSH-23对p65、p-p65表达及入核情况的影响。再给予WT小鼠腹腔注射(Intraperitoneal inj ection,i.p.)L-KYN,观察小鼠抑郁样行为。Western blotting方法检测小鼠海马组织NLRP2炎症小体及Caspasel、IL-lβ表达水平。WT小鼠海马脑区立体定位注射含GFAP启动子的NLRP2腺相关病毒,敲低NLRP2,再腹腔注射L-KYN,检测其抑郁样行为。Western blotting检测p65、p-p65、Caspasel、GSDMD、IL-1β表达水平。结果:1)CMS小鼠外周血清及海马组织匀浆犬尿氨酸、犬尿喹啉酸含量显著增加,FLX抑制CMS小鼠外周血清及海马组织匀浆犬尿氨酸、犬尿喹啉酸含量;2)离体培养原代星形胶质细胞,L-KYN+ATP刺激诱导星形胶质细胞焦亡;3)单用L-KYN上调星形胶质细胞NLRP2的表达,对NLRP3表达无明显影响;4)敲低NLRP2抑制L-KYN+ATP诱导的星形胶质细胞焦亡,敲低NLRP3不能抑制L-KYN+ATP诱导的星形胶质细胞焦亡;5)L-KYN激活NF-κB,促使NF-kB入核上调NLRP2的表达;6)L-KYN可诱导小鼠抑郁样行为;7)L-KYN显著增加小鼠外周血清中IL-lβ含量;8)L-KYN可上调小鼠海马脑区NLRP2炎症小体、Caspasel、IL-lβ表达;9)AAV-eGFP L-KYN组小鼠糖水偏好显著低于对照组,强迫游泳不动时间、悬尾不动时间显著高于对照组,而特异性敲低星形胶质细胞NLRP2炎症小体可改善L-KYN诱导的小鼠抑郁样行为,且在蛋白水平降低L-KYN引起的GSDMD、Caspasel、IL-1β表达增多。结论:1)在体L-KYN通过NLRP2炎症小体,诱导星形胶质细胞焦亡,参与抑郁症病理过程;2)离体L-KYN+ATP促使p65入核上调NLRP2的表达、激活Caspasel,诱导星形胶质细胞焦亡。第三部分SSRIs调控抑郁症中星形胶质细胞焦亡的机制目的:阐明SSRIs调控抑郁症中星形胶质细胞焦亡的机制。方法:运用β-arrestin2+/+、β-arrestin2-/-鼠制备CMS模型,Western blotting检测CMS小鼠海马组织Caspasel、GSDMD、IL-1β表达水平。离体培养β-arrestin2+/+、β-arrestin2-/-原代星形胶质细胞,先给予5-HT2BR特异性抑制剂SR127445处理,再给予FLX或西酞普兰(Citalopram,Cit)预处理,最后给予脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)+ATP 或L-KYN+ATP刺激,采用CCK8检测细胞毒性,YO-pro-1 iodide/EthD2双染检测细胞焦亡,Western blotting检测细胞上清及胞质中Caspasel、GSDMD、IL-lβ表达水平。Co-IP检测β-arrestin2与NLRP2结合情况,免疫荧光进一步确认其分布。结果:1)相较于β-arrestin2+/+CON组,β-arrestin2+/+CMS组小鼠Caspasel/11激活、GSDMD切割、IL-lβ分泌显著增加,FLX显著改善Caspasel/11激活、GSDMD切割、IL-lβ分泌,而β-arrestin2-/-取消了FLX改善Caspasel/11激活、GSDMD切割、IL-lβ分泌的作用;2)相较于β-arrestin2+/+CON组,β-arrestin2+/+L-KYN+ATP组星形胶质细胞Caspasel激活、GSDMD切割以及上清Caspasel、IL-lβ分泌显著增加,FLX显著改善Caspasel激活、GSDMD切割以及上清Caspasel、IL-1β分泌;3)β-arrestin2-/-取消了FLX改善Caspasel激活、GSDMD切割以及上清Caspasel、IL-lβ分泌的作用;SR127445也取消了FLX改善Caspasel激活、GSDMD切割以及上清Caspasel、IL-1β分泌的作用;LPS+ATP刺激星形胶质细胞与L-KYN+ATP刺激星形胶质细胞有类似的效应;Cit与FLX一致,也具有相似的抗焦亡作用;4)SSRls促进β-arrestin2与NLRP2结合抑制星形胶质细胞NLRP2活化。结论:SSRls通过5-HT2BR促进β-arrestin2与NLRP2结合,抑制星形胶质细胞NLRP2炎症小体介导的焦亡,发挥抗抑郁作用。综上所述,本文工作的主要创新之处在于:1、揭示星形胶质细胞焦亡在抑郁症病理进程中的重要作用,深化了对抑郁症病理机制的认识;2、发现内源性代谢产物犬尿氨酸通过NLRP2炎症小体介导星形胶质细胞焦亡的作用及机制,进一步证实抑郁症的神经炎症假说,为靶向炎症小体的抗抑郁药物开发积累学术基础;3、阐明了β-arrestin2在SSRls抗星形胶质细胞焦亡中的作用,拓展了SSRls的药理机制。