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以PCV1基因组和重组质粒pCI-PCV2-ORF1为模板,分别扩增出PCV1和PCV2的ORF1基因,然后亚克隆到pET-28a(+)、pET-32a(+)以及pGEX-4T-1三种原核表达载体上,获得5个测序正确的重组质粒和1个缺失突变重组质粒pGEX-4T1-PCV2-dORF1。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株进行目的基因的诱导表达。结果显示,PCV1和PCV2的ORF1均能在pET28a(+)中实现与6个组氨酸(6×His)融合表达,产生重组蛋白His-Rep,也能在pET32a(+)中与硫氧还蛋白(Trx)、6×His等标签多肽(Trx-His)融合表达,产生重组蛋白Trx-His-Rep。但在pGEX-4T-1中,只有第746位和第747位两个碱基缺失的PCV2-ORF1(PCV2-dORF1)可以与载体上的谷胱甘肽转移酶(GST)融合表达产生GST-dRep蛋白,完整的PCV1-ORF1不表达。经过可溶性表达的初步探索后,PCV2 GST-dRep呈部分可溶表达,His-Rep和Trx-His-Rep以不溶的包涵体形式表达。应用商品化试剂盒对表达产物进行纯化和蛋白定量(BCA法),获得了高纯度的重组Rep蛋白,推算出PCV1和PCV2的His-Rep产量分别为34 mg／L菌液和14 mg／L菌液,相应的Trx-His-Rep产量分别为12 mg／L菌液和10 mg／L菌液,PCV2 GST-dRep可溶性蛋白的产量为5 mg／L菌液。这些纯化后的重组Rep蛋白在Western-blotting中能够与猪抗PCV2阳性血清发生特异性反应,显示出良好的免疫学活性。选取PCV1和PCV2的高纯度His-Rep蛋白作为抗原分别免疫BALB／c鼠,利用杂交瘤技术建立了4株能稳定分泌抗PCV1-Rep和10株能稳定分泌抗PCV2-Rep单克隆抗体(单抗)的杂交瘤细胞株。然后,通过间接ELISA、Western-blotting和间接免疫荧光实验(IFA)对这些单抗结合抗原的能力与特异性进行了鉴定。结果显示,单抗1El和3E12(来自PCV1His-Rep),以及2H10、6H9和3A7(来自PCV2 His-Rep),均可同时识别PCV1和PCV2的His-Rep以及存在于PCV感染过(72 h PI)的PK-15细胞内的天然Rep；来自PCV1 His-Rep的单抗1B5仅识别PCV1 His-Rep及其天然Rep蛋白,来自PCV2 His-Rep的单抗3B1和5D8也只识别PCV2 His-Rep及其天然Rep蛋白,这三种单抗都不与另一基因型PCV的Rep蛋白发生交叉反应；其余6株单抗,包括来自PCV1 His-Rep的5C10以及来自PCV2 His-Rep的2C8、2D9、3F10、3G7和1H7,除1H7只识别自身抗原外,其余5株还能与另一基因型PCV的His-Rep发生交叉反应,遗憾的是它们都不与天然Rep蛋白发生反应。由此,我们推测,单抗1B5结合PCV1特异性表位,3B1和5D8结合PCV2特异性表位,1E1、3E12、2H10、6H9和3A7针对的抗原表位在PCV1和PCV2之间都存在或重叠。其余6株单抗无法结合天然Rep蛋白,可能与变性His-Rep和天然Rep在构象上的差异有关。综上所述,本研究建立并优化了PCV1和PCV2 Rep蛋白的原核表达系统,为猪圆环病毒病的免疫学诊断提供了候选抗原；同时,还制备了针对Rep蛋白的特异性单抗,尤其是PCV基因型特异性单抗(1B5、3B1和5D8),为PCV1与PCV2的鉴别诊断提供了有利工具。