研究背景:我国是世界上高原面积最为辽阔的国家,高原面积约占全国土地面积的1/6,且高原地区人口众多,经济和战略地位十分重要。随着西部大开发战略的发展,进入高原地区的人员与日俱增,高原低氧对新入高原人员、高原建设者、移居者的身心健康造成重大影响。因此,探讨高原低氧损伤的防治措施,对于维护和提高高原作业者的身心健康和作业能力,满足高原地区国防安全、重大工程建设、应急抢险救灾等,均具有非常重要的意义。高原低氧环境下,机体通过一系列代偿性低氧调节反应摄取更多的氧以改善组织供氧,其中红系造血的代偿性调节至关重要。红系造血的调节作用主要是通过红系优势定向分化、促进红系祖细胞朝向成熟红细胞的分化,使机体适应低氧环境,减轻低氧对机体的损伤。K562细胞是一种具有多向分化潜能的造血系统恶性肿瘤细胞,在体外诱导,可以向红系、单核系或巨核细胞系方向分化,是研究造血细胞增殖分化常用的细胞模型。白藜芦醇(resveratrol,Res)是天然的非黄酮类多酚化合物,已有研究显示Res可以促进K562细胞向红系分化,但具体机制及其对血红蛋白(Hb)合成的影响尚不完全清楚,有关Res在抗缺氧方面的研究还未见报道。因此,本课题以慢性粒细胞白血病细胞株K562细胞为研究对象,探讨Res对K562细胞红系分化及血红蛋白合成的影响及机制;并通过小鼠密闭缺氧实验,初步探讨Res的抗缺氧作用及其作用机制,为Res在高原医学方面的应用提供理论依据。研究目的:观察常氧和低氧条件下不同浓度Res作用于K562细胞后,对K562细胞增殖、凋亡、分化及血红蛋白合成的影响,并对其可能作用机制进行初步探讨。同时,通过体外小鼠的常压密闭缺氧实验,初步探讨Res的抗缺氧作用及其作用机制。研究方法:细胞实验:1.Res对K562细胞增殖、凋亡的影响:增殖和凋亡实验均分为空白对照组和不同浓度Res实验组,实验组分别给予终浓度为12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L的Res工作液,对照组给予等量的含1%DMSO的1640溶液。分别放入常氧和低氧(2%O2)培养箱中培养,24h、48h和72h后采用CCK-8法检测Res对K562细胞增殖的影响,采用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒,以流式细胞仪分析测定Res对K562细胞凋亡的影响,并确定下一步实验Res的干预浓度和时间。2.Res对K562细胞红系分化的影响:该部分实验分为未诱导实验和诱导实验两个部分,未诱导实验部分分为空白对照组(含1%DMSO的1640溶液)、25μmol/L Res组和40μmol/L氯化血红素(Hemin,阳性对照)组。分别在常氧和低氧(2%O2)条件下作用细胞24h。诱导部分实验分为空白对照组和Res组(处理同上),预处理24h后两组均再用Hemin诱导48h。实验结束后采用联苯胺染色和分光光度法检测各组细胞联苯胺染色阳性率(Hb阳性率)、细胞中血红蛋白含量变化和细胞平均血红蛋白含量(MCH)。3.Res对K562细胞红系分化相关基因表达的影响:实验分为空白对照组(含1%DMSO的1640溶液)和25μmol/L Res组,干预24h后,采用实时荧光定量PCR方法检测在常氧和低氧(2%O2)条件下Res对K562细胞红系分化相关基因α-珠蛋白、β-珠蛋白、γ-珠蛋白、GATA-1、NF-E2 m RNA表达的影响,检测低氧条件下Res对HIF-1α、EPO、EPOR m RNA表达的影响。动物实验:小鼠常压密闭缺氧实验:50只小鼠随机分为空白对照组、Res低剂量组、Res中剂量组、Res高剂量组和新复方党参组,每组10只。空白对照组给予0.5%的羧甲基纤维素(溶剂),Res低、中、高剂量组的给药剂量分别为25mg/kg体重、50mg/kg体重、100mg/kg体重,新复方党参组给予新复方党参250mg/kg体重,以0.1ml/10g体重的灌胃体积给予灌胃,连续灌胃14天。于末次灌胃1h后进行常压密闭抗缺氧实验,以小鼠最后一次呼吸停止的时间为准,记录小鼠的存活时间,检测各组小鼠血清、心、肝和肺的总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性、总抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)水平。研究结果:1.Res对K562细胞增殖的影响:常氧和低氧(2%O2)条件下,不同浓度Res干预K562细胞24h、48h和72h后,对K562细胞的抑制率与对照组相比均显著增加(P<0.05)。K562细胞的抑制率在25μmol/L~100μmol/L的浓度范围内随浓度的增加而增大,在100μmol/L时抑制率达到最高;在同一作用浓度下,K562细胞的抑制率随作用时间的延长而增大,在72h时抑制率达到最大值。在相同的时间和浓度下,低氧(2%O2)条件下Res对K562细胞的抑制率明显高于常氧条件下细胞的抑制率(P<0.05)。2.Res对K562细胞凋亡的影响:常氧和低氧(2%O2)条件下,不同浓度Res作用K562细胞24h、48h和72h后,各Res干预组K562细胞的凋亡率与其对照组相比均明显增大(P<0.05);在同一作用时间下,K562细胞的凋亡率在25μmol/L~100μmol/L的浓度范围内随浓度的增加而增大。3.Res对K562细胞红系分化的影响:1)Res对K562细胞中血红蛋白含量变化的影响常氧和低氧(2%O2)条件下Res分别作用于K562细胞24h后(未诱导实验),常氧条件下Res组OD值为0.067±0.001,与空白对照组(0.069±0.001)相比无明显差异,与Hemin组(0.087±0.001)比较差异具有统计学意义(P<0.05);低氧条件下Res组OD值为0.069±0.001,与空白对照组(0.068±0.001)相比没有明显差异,与Hemin组(0.081±0.001)相比有明显差异(P<0.05)。在Res预处理24h再用Hemin诱导48h实验(诱导实验)中,常氧条件下,Res预处理组OD值为0.121±0.001,与未预处理组(0.106±0.002)相比明显增加(P<0.05);低氧条件下Res预处理组OD值为0.121±0.001,与未预处理组(0.104±0.002)比较有显著性差异(P<0.05)。提示在常氧和低氧(2%O2)条件下Res作用于K562细胞均不能直接引起其血红蛋白含量变化,但Res预处理可以增加Hemin诱导的细胞中血红蛋白含量。2)Res对K562细胞平均血红蛋白含量(MCH)的影响未诱导实验结果显示:常氧条件下Res组MCH(pg)为3.54±0.53,与空白对照组(3.20±0.64)相比差异没有统计学意义,与Hemin组(5.27±0.53)比较差异有统计学意义(P<0.05);低氧条件下Res组MCH为4.45±1.17,与空白对照组(4.20±0.31)相比无明显差异,与Hemin组(6.44±0.31)比较有显著性差异(P<0.05)。诱导实验结果显示:常氧条件下Res预处理组MCH为4.46±0.30,与未预处理组(3.56±0.34)相比明显增加(P<0.05);低氧条件下Res预处理组MCH为7.69±0.19,与未预处理组(5.88±0.91)相比显著增多(P<0.05)。提示在常氧和低氧(2%O2)条件下Res作用均不能直接增加K562细胞的MCH,而Res预处理能够增加Hemin诱导的细胞MCH。3)Res对K562细胞Hb阳性率的影响未诱导实验结果显示:常氧条件下Res组细胞Hb阳性率(%)为0.60±0.20,与空白对照组(0.60±0.20)比较无统计学差异,却明显低于Hemin组(4.87±0.31);低氧条件下Res组Hb阳性率为1.87±0.31,与空白对照组(1.73±0.31)相比无明显差异,但显著低于Hemin组阳性率(10.93±1.01)(P<0.05)。诱导实验结果显示:常氧条件下Res预处理组Hb阳性率为9.13±0.81,与未预处理组(5.00±1.00)比较增加明显(P<0.05);低氧条件下Res预处理组Hb阳性率(%)为33.00±1.00,与未预处理组(14.40±1.44)相比显著性增加(P<0.05)。提示在常氧和低氧(2%O2)条件下Res作用于均不能直接增加K562细胞的Hb阳性率,而Res预处理均能增加Hemin诱导的细胞Hb阳性率。4.Res对K562细胞红系分化相关基因表达的影响:常氧和低氧(2%O2)条件下Res分别作用于K562细胞24h后,常氧条件下Res组α-珠蛋白、β-珠蛋白、γ-珠蛋白、GATA-1、NF-E2 m RNA的相对表达量分别为1.52±0.13、1.41±0.14、1.23±0.08、1.24±0.10、1.25±0.04;低氧条件下Res组α-珠蛋白、β-珠蛋白、γ-珠蛋白、GATA-1、NF-E2 m RNA的相对表达量分别为1.64±0.17、1.23±0.06、1.23±0.08、1.16±0.04、1.24±0.05,较对照组均明显增加(P<0.05)。提示Res在常氧和低氧(2%O2)条件下均可以上调红系分化相关基因的表达。5.低氧条件下Res对K562细胞HIF-1α、EPO、EPOR m RNA表达的影响:低氧(2%O2)条件下Res作用于K562细胞24h后,Res组HIF-1α、EPO、EPOR m RNA的相对表达量分别为1.32±0.14、1.45±0.03、1.91±0.02,与对照组比较显著性提高(P<0.05)。提示Res在低氧(2%O2)条件下可以上调HIF-1α、EPO、EPOR的表达。6.Res对缺氧小鼠生存时间的影响:常压密闭缺氧实验显示:空白对照组、Res低剂量组、Res中剂量组、Res高剂量组和新复方党参组小鼠的生存时间(min)分别为:25.91±2.35、25.78±2.74、26.21±2.48、33.34±3.86、33.03±6.12,其中Res高剂量组和新复方党参组与空白对照组相比小鼠的生存时间均明显延长(P<0.05),Res高剂量组与新复方党参组相比无显著性差异。提示Res能够延长小鼠在缺氧条件下的生存时间,具有抗缺氧作用。7.Res对缺氧小鼠氧化抗氧化能力的影响:测定各组小鼠血清、心脏、肝脏和肺脏组织T-SOD、T-AOC和MDA水平,结果显示:与空白对照组相比,Res组(除肝脏组织外)和新复方党参组小鼠血清和组织中T-SOD和T-AOC活性均明显提高(P<0.05);Res组和新复方党参组血清和组织中MDA的含量均明显降低(P<0.05)。提示Res具有良好的抗氧化作用,可以增强小鼠的抗缺氧能力。结论:1.白藜芦醇可以浓度和时间依赖性地抑制K562细胞的增殖。2.白藜芦醇可以浓度依赖性地促进K562细胞的凋亡。3.白藜芦醇不能直接增加K562细胞的血红蛋白合成,但可以通过上调红系分化相关基因α-珠蛋白、β-珠蛋白、γ-珠蛋白、GATA-1、NF-E2及低氧条件下HIF-1α、EPO、EPOR的表达增强Hemin诱导的血红蛋白合成能力,发挥其促红系分化作用。4.白藜芦醇可以显著延长常压密闭缺氧小鼠的存活时间,具有抗缺氧作用;白藜芦醇可以增强小鼠血清和组织中T-SOD和T-AOC活性,降低MDA含量,这可能是其抗缺氧的机制之一。