油菜的多室性状具有每角果粒数明显增多的优势,研究和创建多室种质资源将为油菜高产育种提供更多途径。本实验室先前对白菜型油菜黄籽沙逊多室基因进行了图位克隆和功能验证,证明Br CLV3基因单核苷酸突变导致茎顶端分生组织增大、角果心室数目数增加和每角果粒数增多。本研究继续进行白菜型油菜多室同源基因的克隆和比较测序;同时结合遗传分析以及多室候选基因的功能验证确定多室角果产生的遗传和分子机理。另外,利用转基因技术和CRISPR/Cas9基因编辑技术在甘蓝型油菜中成功获得Bn CLV1、Bn CLV2、Bn CLV3多室突变体,并实现在三个世代中突变稳定遗传,本研究结果将为油菜的多室性状运用提供理论依据,更为高产育种提供新的基因资源。1.白菜型油菜中多室基因的克隆与功能验证对白菜型多室突变体桑日白（srb）的花器官、角果、顶端分生组织等表型差异进行了表型分析。与野生型相比,突变体的花器官数目表型为雄蕊数和心皮数增多;单株角果短粗,心室数目为2-4室。正反交测试结果表明该突变体的多室性状由一个隐形核基因调控。等位基因验证结果表明调控srb多室性状的基因极可能是突变体黄籽沙逊（ml4）中已发现的多室基因Brclv3。通过同源基因克隆,确定srb中多室候选基因Brclv3序列,结果发现3处变异,其中只有位于外显子中的1个SNP变异（C变成G）可以导致单个氨基酸替换（由组氨酸突变成天冬氨酸）。该突变氨基酸位于功能域CLE motif的第12位,与ml4中已发现的第9位氨基酸替换不同,是一个新的等位突变,均可以引起CLV3多肽的突变。拟南芥中异位表达Brclv3Asp12可以部分恢复拟南芥clv3-2的突变表型。施加外源多肽处理拟南芥,突变型Br CLV3ASP12多肽对拟南芥顶端和根尖的抑制作用介于空白对照和野生型CLV3多肽处理之间,进一步表明Brclv3Asp12中的组氨基酸/天冬氨酸突变可以引起多肽活性的部分丧失,使其不能正常调控茎顶端分生组织的生长,从而导致多室角果的产生。2.同源共抑制方式创建甘蓝型多室材料构建Brclv3Leu9多室基因的超量表达载体,通过转基因方式,在甘蓝型油菜中进行异源表达。在T0代具有发现多室表型的35S::Br CLV3-19（OE19）单株,多世代表型筛选获得多室比例99%-100%的多室单株,角果为4室,单株生长正常,且每角果粒数和每角果粒重显著高于野生型。分别对多室单株的二室、三室、四室角果考种,发现每角果粒数随着心皮数增加而增加。通过对花序顶端中内外源基因以及CLV3-WUS调控途径相关基因的表达检测发现,OE19材料中Br CLV3表达量很低,并且Bn CLV3基因表达量下调,总CLV3表达量显著低于野生型,表明外源基因同源共抑制内源基因的表达,导致Bn CLV3对WUS基因的抑制作用减弱,从而产生多室性状。3.甘蓝型油菜中Bn CLV基因调控多室角果的发育在甘蓝型油菜中同源克隆Bn CLV1、Bn CLV2、Bn CLV3基因,确认基因序列及基因结构,并利用Southern杂交试验证明Bn CLV3基因在甘蓝型油菜中只有两个拷贝。分别对Bn CLV1、Bn CLV2、Bn CLV3基因编辑设计多个sg RNA靶点,构建CRISPR/Cas9基因编辑载体,转化甘蓝型油菜。靶向Bn CLV1、Bn CLV2、Bn CLV3基因都成功编辑,其中不同sg RNAs靶点编辑效率差异较大,为0%-48.65%,似乎sg RNAs靶点核苷酸组成对编辑效率有较大影响,说明选择合适的sg RNA靶点对油菜高效编辑具有重要意义。BnCLV1、Bn CLV2、Bn CLV3编辑材料在T0代都有少数单株表现为多室表型,并实现在三个世代中突变基因型和表型的稳定遗传。在T1或T2后代中筛选到大量不同基因型的单突变体和双突变体,发现多室表型单株都是纯合双突变体,说明Bn CLV1、Bn CLV2、Bn CLV3基因拷贝间具有功能冗余。针对Bn CLV3单突变体和双突变体进行产量相关性状考查,发现双突变体产生更多的叶片,角果短粗,心室数目剧增,每角果粒数和每角果粒重显著高于野生型和单突变体植株,表明获得双突材料可能有助于产量的提高。利用高通量测序方法,对57个潜在的脱靶位点进行检测,均没有脱靶现象产生。此外,我们还评估了通过传粉方式水平转移sg RNA/Cas9表达盒后的编辑效率。本研究对丰富和充实油菜种质资源以及油菜的高产育种具有重要的现实意义,也为基因编辑技术应用于油菜遗传改良提供了借鉴。