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目的:运用经典的鸡尾酒和胰岛素诱导小鼠3T3-L1前脂肪细胞及新生小鼠棕色前脂肪细胞分化成熟,观察胰岛素受体底物-1(insulinreceptor substrate-1,IRS-1)在二者分化过程中的表达模式。
方法:应用3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine,IBMX)0.5mM,地塞米松(Dexamethasone,DEX)10-6M和胰岛素(Insulin,Ins)5μg/mL诱导小鼠3T3-L1前脂肪细胞及新生小鼠棕色前脂肪细胞分化成熟,分别在第0、2、4、6、8、10、12、14天及第0、2、6、9天收集细胞。用实时定量PCR检测3T3-L1前脂肪细胞分化过程中不同时间点IRS-1和脂质过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisome Proliferators-activated receptorγ,PPARγ)mRNA的表达；免疫印迹法(Western Blot)检测3T3-L1前脂肪细胞和小鼠棕色前脂肪细胞分化过程中不同时间点IRS-1和PPARγ蛋白的表达；用油红O染色观察3T3-L1前脂肪细胞和小鼠棕色前脂肪细胞分化过程中不同时间点脂肪细胞内脂滴的形成。
结果:在小鼠3T3-L1前脂肪细胞分化成熟为脂肪细胞的过程中,IRS-1 mRNA的表达在诱导第4天后显著增高,第8天之后增高尤为明显,IRS-1蛋白在第0天和第2天的表达量低,第4天之后,IRS-1蛋白的表达开始逐渐增高,一直持续到第14天,与IRS-1 mRNA的表达基本一致。PPAγ mRNA的表达逐渐增加,其蛋白在0天即有表达,蛋白的表达量随脂肪细胞的成熟而逐渐增高。油红O染色可见3T3-L1前脂肪细胞于诱导后2天开始出现小脂滴,4天出现明显桔红色脂滴,6天80％的3T3-L1前脂肪细胞内出现多个大小不等的桔红色脂滴,8到10天,3T3-L1前脂肪细胞基本分化成熟,光学显微镜下观察整个视野一片桔红色。在小鼠棕色前脂肪细胞分化过程中,IRS-1蛋白在加入鸡尾酒诱导后两天显著增高,第6天IRS-1蛋白的表达降低,低于0天的水平,第9天略低于第6天。PPARγ蛋白的表达量随小鼠棕色前脂肪细胞的成熟而逐渐增高。油红O染色可见小鼠棕色前脂肪细胞于诱导后2天开始出现小脂滴,6天出现明显桔红色脂滴,9天60％的小鼠棕色前脂肪细胞内出现大小不等的桔红色脂滴。
结论:鸡尾酒加胰岛素刺激能诱导小鼠3T3-L1前脂肪细胞和新生小鼠棕色前脂肪细胞分化成熟；IRS-1的表达对白色脂肪细胞的发育具有正性调控作用,IRS-1不但参与小鼠3T3-L1前脂肪细胞晚期分化成熟过程,还可能参与成熟脂肪细胞脂滴的分泌与释放；而在新生小鼠棕色前脂肪细胞分化成熟过程中,IRS-1蛋白的表达与3T3-L1前脂肪细胞分化成熟过程的表达模式明显不同,IRS-1蛋白的表达受胰岛素的短暂调节而升高,但极有可能对棕色脂肪细胞脂滴的释放起着负性调节作用。
目的:观察胰岛素受体底物-1表达受阻对小鼠3T3-L1前脂肪细胞增殖、分化及PPARγ表达的影响。
方法:针对小鼠IRS-1基因开放阅读框上的2个区域(分别为1135-1155和1429-1447)合成shRNA(M和MH),以pGenesil-1 vector为载体构建带绿色荧光蛋白(Green Fluorescence Protein,GFP)靶标的shRNA质粒。以脂质体LipofectaminTM2000介导转染3T3-L1前脂肪细胞,并设阴性对照(HK)载体转染组。细胞转染后,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达状况而确定转染效率,G418筛选稳定表达的阳性克隆并通过Western blot鉴定。用MTT法测定细胞存活率,[3H]-脱氧脲嘧啶掺入法检测细胞的增殖活性。应用IBMX0.5mM,DEX10-6M和Ins5μg/mL分别诱导小鼠3T3-L1前脂肪细胞空白对照组、阴性对照(HK)载体转染组、M和MH转染组分化,在诱导分化的不同时间点收集细胞。用Western Blot检测PPARγ的表达。脂肪细胞内脂滴用油红O染色观察。
结果:转染后48小时,在荧光显微镜下观察,可见部分细胞呈现绿色荧光,经G418筛选得到稳定表达的阳性克隆。与空白对照组、阴性对照组和转染M组IRS-1 shRNA质粒的3T3-L1前脂肪细胞相比,转染MH组IRS-1 shRNA质粒的3T3-L1前脂肪细胞IRS-1蛋白表达水平降低70％以上。与空白对照组、阴性对照组和转染M组IRS-1 shRNA质粒的3T3-L1前脂肪细胞比较,MH转染组细胞存活率分别降低(45±4.2)％、(47±4.0)％和(44±4.5)％(P<0.05),其增殖活性分别降低(54±4.8)％、(62±5.6)％和(52±4.9)％(P<0.05)；而MH转染组细胞PPARγ蛋白的表达与空白对照组、阴性对照组和转染M组IRS-1shRNA质粒的3T3-L1前脂肪细胞比较无改变。鸡尾酒和胰岛素诱导空白对照组、阴性对照组和转染M组IRS-1 shRNA质粒的3T3-L1前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞成功,PPARγ蛋白在脂肪细胞分化成熟过程中逐渐增高,油红O染色显示,随着脂肪细胞的分化成熟,桔红色脂滴逐渐增多；而转染MH组IRS-1 shRNA质粒的3T3-L1前脂肪细胞经鸡尾酒和胰岛素诱导,油红O染色桔红色脂滴显著减少,直到分化的第8天,才见少许桔红色脂滴,且PPARγ蛋白的表达无变化。
结论:针对小鼠IRS-1 cDNA上1429-1447区域设计、构建的shRNA质粒MH可有效抑制3T3-L1前脂肪细胞IRS-1基因的表达。IRS-1基因沉默后可抑制3T3-L1前脂肪细胞的增殖与分化,并在分化过程中抑制PPARγ的表达,说明IRS-1可能通过胰岛素信号途径参与调节3T3-L1前脂肪细胞的增殖和分化,也能通过调节PPARγ的表达或与PPARγ共同作用在3T3-L1前脂肪细胞的分化中发挥决定性作用。
目的:观察胰岛素受体底物-1表达受阻对小鼠3T3-L1前脂肪细胞分化过程中丝裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路(包括ERK、JNK及p38)和核因子κB(Nuclearfactor-kappa B,NF-κB)信号通路的影响。
方法:用Western blot检测空白对照组和转染IRS-1 shRNA质粒的MH组3T3-L1前脂肪细胞分化过程中各时间点ERK、磷酸化ERK(P-ERK)、JNK、磷酸化JNK(P-JNK)、p38、磷酸化p38(P-p38)、NF-κBp65、磷酸化NF-κBp65(P-NF-κBp65)和IKB-a的表达差异。
结果:小鼠3T3-L1前脂肪细胞分化过程中,ERK在0天即表达很高,一直持续到第6天,第8天开始有所降低,从第8天到第12天,逐渐降低；P-ERK的表达逐渐降低；p38的表达在第2天增高,并持续到第10天才开始下降,诱导12天后,p38表达水平基本与未诱导时持平；JNK的表达从0天到12天都比较稳定,基本保持不变；P-JNK和P-p38从0天到12天均未检测到；NF-κBp65在0天即有表达,第4天表达增加,从第4天到第12天,表达逐渐增高；P-NF-κBp65在整个分化过程中未检测到；IKB-a的表达基本与NF-κBp65的表达相反；IRS-1基因沉默后,小鼠3T3-L1前脂肪细胞分化过程中,ERK和p-ERK的表达从0天到12天均无变化；JNK和p38的表达从0天到12天都比较稳定,P-JNK和P-p38从0天到12天未见有表达；NF-κBp65的表达在第2天和第4天降低,第6天以后又恢复到与0天相当的水平；P-NF-κBp65在整个分化过程中未检测到；IKB-a的表达基本与NF-κBp65的表达相反。
结论:IRS-1可能通过负性调节ERK和正性调节NF-κB信号途径促进3T3-L1前脂肪细胞的分化成熟,在脂肪细胞的分化中发挥重要作用；IRS-1可能是脂肪细胞发育中ERK/p38 MAPK和NF-κB信号转导通路中的重要上游分子；p38在3T3-L1前脂肪细胞诱导分化过程中的表达具有双向性,IRS-1基因沉默后,p38的表达在3T3-L1前脂肪细胞诱导分化过程中不再发生改变,可能与IRS-1基因剔除致细胞增殖下降有关。