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在环境无机氮缺乏条件下,有机氮特别是游离氨基酸为植物潜在的氮源形式。大型海藻关于有机氮利用的报道较为少见,因此本文就大型海藻龙须菜在氨基酸为唯一氮源的条件下的生理生化及转录水平的响应展开研究。 本文以龙须菜07-2品系为实验材料,对经过缺氮处理8天的龙须菜施以不同形式的氮源进行培养,以50μM氨基酸包括谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸为处理氮源,以50μM无机氮(NH4+:NO3-=2:1)为对照组氮源培养10天,测定了DNA含量、色素蛋白含量、蛋白质含量、可溶性糖含量以及氨基酸含量等生理生化指标以及部分基因转录水平的研究,探讨在四种氨基酸处理下大型海藻龙须菜的生理生化和基因转录水平的响应。结果表明,各氨基酸处理组均在一定程度上促进了缺氮藻体的生长,处理第2天各氨基酸处理组平均DNA含量约为缺氮第8天的2.10±0.123倍,氨基酸处理组的平均可溶性蛋白含量约为缺氮第8天的1.06±0.13倍,而氨基酸(除天冬氨酸外)处理组的平均可溶性糖含量较缺氮第8天下降约25%,而天冬氨酸处理组的可溶性糖含量较缺氮第8天上升约15%。可见,各氨基酸处理均能促进缺氮藻体的生长和可溶性蛋白的合成,同时,不同氨基酸对藻体可溶性糖含量的影响不尽相同,谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺处理下藻体可溶性糖含量下降而天冬氨酸处理下藻体可溶性糖含量上升。这是由于外源谷氨酰胺、谷氨酸和天冬酰胺在藻体中的代谢不促进糖异生的作用,而天冬氨酸在藻体中促进了细胞糖异生作用所致。此外,实验分析的结果表明,以氨基酸为氮源处理藻体期间,藻体氨基酸含量大致呈逐渐上升的趋势,而以缺氮第8天为基准对各氨基酸含量数据标准化后分析发现,各氨基酸处理组藻体中氨基酸含量上升幅度最大为天冬氨酸和苏氨酸,其次为谷氨酰胺或甘氨酸,而后是天冬酰胺、丝氨酸、谷氨酸、缬氨酸等氨基酸。根据这些氨基酸在细胞中的代谢位置,我们大致把外源氨基酸在细胞中的代谢锁定在GS/GOGAT循环、糖酵解途径和TCA循环这三大代谢中心。 为了进一步探究各外源氨基酸(谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸)在藻体中的代谢,我们对各处理下的藻体进行了与氮吸收和碳氮代谢相关的酶或蛋白在转录水平上的表达分析。首先,我们分析了与蛋白质合成有关的基因RPS9和RPL27A,发现为缺氮藻体恢复供应外源氮在一定程度上促进了胞质蛋白质的合成,这与以氨基酸处理下可溶性蛋白含量的增加现象是一致的。此外,在所有处理组中,谷氨酸处理下无机氮同化相关酶基因Fd型谷氨酸合成酶基因gltB和硝酸还原酶NAR以及NH4+转运蛋白AMT首先呈现较大幅度的上调,而后维持在较稳定的表达水平,增加细胞内氮同化行为直接促进了胞内总氨基酸含量的上升,其调控模式异于无机氮对照组(gltB、NAR和AMT的表达水平在处理初期处于较低水平,而后逐渐上调)。同时,天冬氨酸与谷氨酸处理下转氨酶(羟甲基丝氨酸转移酶、丙氨酸转氨酶)以及丙酮酸脱氢酶响应最为明显,酰胺类氨基酸处理下相关转氨酶基因的表达水平变化模式接近于无机氮对照组。而丙酮酸激酶对外源氮的响应幅度较大,不同氮源种类处理下没有显著性差异,说明酸性氨基酸在细胞内经过相似的转氨作用被代谢,而酰胺类氨基酸的代谢模式则与无机氮的代谢模式相似,这从侧面说明了酰胺类氨基酸藻体的生长情况接近于无机氮对照组。所有氨基酸处理均促进了糖酵解作用和TCA循环,但不同外源氨基酸对糖酵解作用和TCA循环的调控机制不尽相同。以α-酮戊二酸为碳骨架的谷氨酰胺和谷氨酸主要通过AlaT协调着糖酵解作用和TCA循环,而以草酰乙酸为碳骨架的天冬酰胺和天冬氨酸则以AspAT和GABA-T的作用为主。 综上所述,不同外源氨基酸在代谢途径和代谢结果上的差异导致了龙须菜对酰胺类氨基酸的偏好性;根据碳骨架的不同直接导致了外源氨基酸分别进入不同的转氨作用被代谢从而引起特有的生理响应。外源氨基酸可作为龙须菜的氮营养直接来源。外源氨基酸的存在补充了龙须菜的氮库容量;外源氨基酸能促进龙须菜的正常生长和光合作用,通过一系列转氨酶的作用促进细胞的碳氮代谢、维持了细胞的碳氮平衡,维持了细胞正常的能量吸收与代谢,促进了蛋白质的合成。