【摘 要】
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几丁质酶可以降解真菌细胞壁,从而抑制真菌生长,因此能分泌几丁质酶的微生物可以作为生防菌加以研究利用。由作者筛选的L03菌株能分泌几丁质酶,其活性为0.702U/mL。经16SrDNA
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几丁质酶可以降解真菌细胞壁,从而抑制真菌生长,因此能分泌几丁质酶的微生物可以作为生防菌加以研究利用。由作者筛选的L03菌株能分泌几丁质酶,其活性为0.702U/mL。经16SrDNA序列测序与Blast比对,该菌株与中华根瘤菌属等属的细菌相似性达99%;与近似种比较试验显示,L03菌株的生理生化性状与中华根瘤菌属细菌相似,认为L03菌株为中华根瘤菌属细菌(Sinorhizobium sp.)。L03菌株分泌的几丁质酶能够用90%饱和浓度的硫酸铵沉淀,沉淀物经脱盐后得到粗酶液。粗酶液先进行Phenyl-Sepharose 6 Fast Flow疏水层析,分离出7个蛋白峰,其中仅峰4具几丁质酶活性;将峰4蛋白再经DEAE-Sephrose Fast Flow离子交换层析得到7个蛋白峰,其中峰4-5蛋白能降解几丁质;峰4-5蛋白经Sephadex G-75凝胶过滤后有3个峰,峰4-5-1具有酶活性。因此峰1蛋白为L03菌株产生的几丁质酶蛋白。收集几丁质酶蛋白,对其进行SDS-PAGE电泳,得出该蛋白的分子量为41.3kDa。L03菌株几丁质酶水解几丁质的最适温度为4045℃,水解反应体系的最适pH为6。几丁质酶在一定环境条件下的稳定性测定结果表明,酶液在40℃以下温度处理1h,酶解性质稳定,各处理酶活性基本相似,但50℃处理1h后活性明显下降;酶液在pH58条件下处理1h,活性基本不变。几丁质酶对一些金属离子敏感,表现在反应体系中加入金属离子后酶活性显著降低,如Ca2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+。但另一些金属离子,对酶活性显著提高,如Mg2+、Ba2+等。L03菌株几丁质酶对多种重要植物病原真菌的细胞壁有明显的降解作用,如水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)、水稻恶苗病菌(Fusarium moniliforme)、小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum)、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、苹果炭疽病菌(Glomerella cingulata)等。用酶液处理病菌后,一般能使菌丝出现细胞壁模糊、颜色变淡现象,甚至还能导致菌丝细胞畸形或菌丝完全崩解。对L03菌株产几丁质酶的条件进行了优化。用均匀设计法在5个因素6个水平上设计试验方案,试验数据用DPS软件分析,得出最佳的培养方法为:最佳碳源为7%胶体几丁质,最佳氮源为0.2%酵母浸出汁(培养基其他成分:0.15%NaNO3,0.05%MgSO4·7H2O,0.3%KH2PO4,0.015%FeSO4·7H2O),培养液初始pH为7.0,培养温度为28℃,培养时间为7d。
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