论文部分内容阅读
平滑肌肌球蛋白(smooth muscle myosin, SmM)是一种重要的分子马达,是平滑肌粗丝的主要成分。通过与肌动蛋白细丝的相互作用,SmM可以将ATP水解产生的化学能转化成构象变化,使粗丝-细丝间发生相互滑动,引起平滑肌收缩。SmM由两条重链、两条必需轻链(Essential light chain, ELC)、以及两条调节轻链(Regulatory light chain, RLC)组成。SmM重链包括位于N端的马达头部(包含ATP水解酶活性中心和细丝结合位点)、轻链ELC和RLC结合位点、以及C端的卷曲螺旋(coiled-coil)。SmM的马达功能受磷酸化调节。在非磷酸化状态下,SmM的马达活性处于抑制状态,其ATP水解酶活力极低;当SmM的RLC轻链被磷酸化后,SmM的马达活性处于高活性状态,具有很高的ATP水解酶活力。大量的研究表明,非磷酸化状态下,SmM的双头之间以及头部与尾部之间存在相互作用,使SmM处于折叠抑制状态;RLC磷酸化后,上述相互作用消失,SmM处于伸展激活状态。由于磷酸化位点位于RLC轻链,与ATP水解酶活性中心相距甚远,一个重要问题是RLC磷酸化如何调节ATP水解酶活性。首先,本论文研究了双头结构在SmM磷酸化调节中的作用。由于早期的实验发现带有一个马达头部的SmM(如单头SmM、S1)的马达活性不受磷酸化调节,并且始终处于高活性状态,因此普遍认为SmM的默认状态是高活性状态;非磷酸化状态下,SmM的双头之间以及头部与尾部之间的相互作用使其处于抑制状态;一旦破坏了这些相互作用,SmM即处于高活性状态。但是上述观点却无法解释后期通过重组表达得到的SmM的结果,如重组表达的单头SmM的活性不受磷酸化调节,但其活力比磷酸化后的双头SmM活力要低很多。为了对确定双头结构在磷酸化调节中的作用,本研究构建了一系列不同尾部长度的SmM截短片段,并且检测了它们的结构和受调节程度。在确定了对于形成稳定双头结构起到关键作用的尾部序列基础上,本研究还发现,在非磷酸化的条件下,actin激活的ATP水解酶活力会随着尾部的截短而增加;在磷酸化条件下,actin激活的ATP酶活力会随着尾部的截短而降低。尤其重要的是,无论磷酸化与否,不带尾部的SmM片段(S1)的活力都远低于磷酸化的双头SmM,但高于非磷酸化的双头SmM。这些实验结果显示SmM双头结构不但是非磷酸化抑制状态所必需的,也是磷酸化激活状态所必需的。据此,本研究提出了SmM磷酸化调节的新模型:SmM的默认活性状态是低活性状态,非磷酸化SmM处于抑制状态,磷酸化SmM的双头间存在协同作用,处于高活性状态。本研究提出的SmM磷酸化调节模型可以解释几乎所有已发表的SmM实验结果。其次,本论文研究了SmM头尾相互作用在维持非磷酸化抑制状态中的作用。大量的研究表明,非磷酸化SmM的头部和尾部相互作用,但其分子机制却不清楚。首先,通过亮氨酸拉链替换的方式鉴定出了对于维持头尾作用的关键尾部区域;其次,通过点突变以及ATP酶活力测定的方式进一步明确是该尾部区域的酸性氨基酸参与了与头部的作用。本论文推测SmM尾部的这些关键酸性氨基酸与头部的碱性氨基酸结合,突变实验显示头部的保守碱性氨基酸R406对维持非磷酸化抑制状态起着关键作用。通过上述研究,本论文证明:双头之间的相互作用在SmM的调节中起着不可或缺的作用,并且提出了SmM磷酸化调节的新模型;确定了尾部的酸性氨基酸以及头部的碱性氨基酸在SmM非磷酸化抑制状态中的作用。这些研究成果不但有助于揭示SmM磷酸化调节的分子机制,对其他分子马达的调节也有一定的借鉴意义。