【目的】探索FMR1KO小鼠突触可塑性调节异常的机制以及如何恢复ACC区的可塑性，以期对进一步认识脆性X综合症的病理机制，发掘潜在的药物治疗新靶点。【方法】1全细胞膜片钳记录小鼠采用1-2%异氟醚麻醉，取脑。振动切片机横向切取300μmACC脑片，室温下置于混合气饱和的人工脑脊液(ACSF)中，恢复1小时后进行实验。在具有红外线DIC系统的显微镜下观察ACC第II/III层锥体神经元。ACSF灌流液中加入100M picrotoxin，刺激电极放置于ACC第V层，记录电极放置于ACC第II/III层，在锥体神经元中选取状态良好的椎体神经元进行封接。记录兴奋性突触后电流（EPSC）和LTP。LTP诱导方法：80次刺激，频率2Hz，同时神经元钳制于+30mV，然后恢复到基线记录模式，钳制电压恢复在-70mV。记录mEPSC时，灌流液中加入TTX，转换为Gap free记录模式。2小鼠前额叶皮层神经元的原代培养取孕18天胎鼠，在无菌条件下断头取脑置于盛有PBS液的平皿中剥去脑膜，取大脑皮层并剪碎，消化后反复吹打制备细胞悬液。接种于涂有多聚赖氨酸的培养皿内，培养箱中进行培养。培养第三天加入阿糖胞苷，以抑制非神经元细胞的继续增长。SKF81297（5μM），DL-AP3（10μM)），和forskolin（5μM）在收集细胞前24小时分组加入培养基，收集细胞待用。3Western blot检测采用常规脑组织样本制备方法制备ACC区组织样品。培养神经元细胞膜蛋白的提取，采用细胞膜蛋白生物素试剂盒提取的方法，提取过程同过往文献报道[1]。Western blot检测方法：将蛋白转到NC膜上后，分别用mGluR5，GluR1，NR2A，NR2B，p-NR2B的一抗封闭各自分子量相应的条带，孵育后，漂洗，加入二抗漂洗发光。曝光完成后，经显影和定影，自来水冲洗，最后在室温下晾干。用β-actin或cadherin作为标准定量分子，确定各个蛋白相对量的多少。4行为学实验开场实验装置由旷场反应箱和数据自动采集和处理系统两部分组成，实验小鼠置于旷场的中央，记录并分析它的运动情况。高架十字迷宫各有两个对称的开放臂和封闭臂，十字中间为正方形平台。实验小鼠逐个放于中央平台后，记录每个小鼠5min内进入开放臂或封闭臂的次数与时间，并计算进入两臂的总次数。Morris水迷宫定位航行实验历时数天,每天将大鼠面向池壁分别从4个入水点放入水中若干次,记录其寻找到隐藏在水面下平台的时间。动物实验小鼠在实验前分别腹腔注射生理盐水，DL-AP3和/或SKF81297，45分钟后开始实验。【结果】1SKF81297和DL-AP3对FMR1基因敲除小鼠LTP的增强我们用全细胞膜片钳的方法对成年脑薄片的前扣带回区II–III层锥体细胞的电生理活动进行记录，采用突触前电刺激诱导突触后去极化的方法使神经元产生LTP并记录。我们发现在FMR1WT小鼠，该脑区神经元产生了明显的长时程增强现象。但在FMR1KO小鼠，这种增强效应不明显。我们发现，正常和敲除小鼠的LTP效应与各自的空白对照组相比没有显著性差异。接下来，我们检测了D1受体激动剂应用组的LTP诱导情况，发现在D1受体激动剂SKF812975μM孵育十分钟后，正常小鼠脑薄片诱导后的LTP效应明显增强,说明激活D1受体能增强正常小鼠的LTP效应。而在FMR1KO小鼠，应用SKF81297没有增强其诱导后的LTP效应，说明D1受体激动剂的LTP增强作用在FMR1基因敲除小鼠ACC区是受损的。我们在检测同时使用D1受体激动剂和mGluR1受体拮抗剂对LTP诱导的影响时，发现SKF81297和DL-AP3共同孵育脑片十分钟，能显著增强正常小鼠的LTP效应，这种增强效应与单独应用D1受体激动剂SKF81297的正常小鼠相比没有显著性差异。在FMR1基因敲除小鼠，同时使用D1受体激动剂和mGluR1受体拮抗剂，ACC区LTP效应与单独使用D1受体激动剂有显著性增强。为了检测合用SKF81297和DL-AP3对FMR1KO小鼠LTP的增强效应是否来源于D1受体激动剂，我们在孵育的液体中同时加入D1受体抑制剂，发现这种LTP增强效应消失。可以认为FMR1KO小鼠LTP的增强效应来源于D1受体激动剂，这种效应是由mGluR1受体拮抗剂恢复的。2腺苷酸环化酶激动剂恢复D1受体激动剂对FMR1KO小鼠ACC区LTP增强效应为了确定增加腺苷酸环化酶的量是否能替代D1受体的作用，我们研究了腺苷酸环化酶激动剂forskolin对FMR1KO小鼠ACC区LTP是否有增强作用。发现加入forskolin且有电刺激诱导的情况下，LTP的幅度与未使用forskolin的FMR1WT小鼠对照组相比无显著性差异。与单独使用forskolin的FMR1WT小鼠组相比，DL-AP3与forskolin结合使用并没有引起FMR1WT小鼠LTP幅度增加。单独使用Forskolin并电刺激诱导LTP的FMR1KO未产生明显的LTP增强效应，而联合使用forskolin和DL-AP3的FMR1KO小鼠LTP有增强。为了确定多巴胺能介导的LTP效应是否需要NMDA受体的激活，我们在灌流液中加入NMDA受体拮抗剂AP5，发现SKF81297介导的LTP增强效应消失。同样，LTP增强效应在灌流液中加入10mM BAPTA后也被阻断，表明多巴胺能介导的LTP效应需要NMDA受体的激活和突触后钙离子浓度增加的。3mGluR1受体介导的可塑性是经由突触后机制产生的我们检测了ACC区的双脉冲易化(PPF)情况。在WT和FMR1KO小鼠ACC区，灌流液中同时或分别加入DL-AP3和SKF81297前后，PPF的五个脉冲间隔产生的突触后反应没有显著性差异。结果表明，突触前递质释放没有改变，mGluR1受体介导的可塑性很可能是经由突触后机制产生的。4mGluR1受体拮抗剂不影响突触的基础谷氨酸能递质释放我们检测了ACC区AMPA受体介导的微小兴奋性突触后电流(mEPSCs)。在灌流液中同时或分别加入DL-AP3和SKF81297，AMPA受体介导的微小兴奋性突触后电流在WT和FMR1KO小鼠ACC区都没有发生显著性变化。表明mGluR1受体拮抗剂不影响突触的基础性谷氨酸能递质释放。5AMPA受体的表达为了确定这种协同作用对AMPA受体的表达和上膜有何影响，我们在培养的PFC细胞中加入D1受体激动剂SKF81297和mGluR1受体拮抗剂DL-AP3。发现单独使用SKF81297或者联合使用DL-AP3都会增加培养的FMR1WT小鼠PFC神经元总的GluR1的表达。而在FMR1KO小鼠，单独使用SKF81297或者DL-AP3都没有改变培养神经元总的GluR1的表达。单独使用SKF81297或者联合使用DL-AP3都会增加培养的FMR1WT小鼠PFC神经元AMPA受体在膜上的表达。SKF81297联合使用DL-AP3增加了培养的FMR1WT小鼠PFC神经元GluR1在膜上的表达。表明mGluR1受体恢复了D1受体激动剂对FMR1KO小鼠PFC细胞AMPA GluR1受体在膜上表达的增强作用。我们检测了DL-AP3和forskolin对培养神经元GluR1向膜转运过程的影响。发现单独使用Forskolin或联合使用DL-AP3都会增加培养的FMR1WT小鼠PFC神经元总的GluR1的表达。单独使用Forskolin或联合使用DL-AP3都没有增加培养的FMR1KO小鼠PFC神经元总的GluR1的表达。而单独使用Forskolin或联合使用DL-AP3都会增加培养的FMR1WT小鼠PFC神经元GluR1在膜上的表达。forskolin联合使用DL-AP3增加了培养的FMR1WT小鼠PFC神经元GluR1受体在膜上的表达。表明D1受体激动剂SKF81297和mGluR1受体拮抗剂DL-AP3在FMR1KO小鼠上的联合作用是通过抑制mGluR1受体，激活腺苷酸环化酶实现的。6mGluR5，D1受体和NMDA受体亚型在PFC培养神经元上的表达通过Western blot检测，发现mGluR5和D1受体以及NMDA受体的两个亚型NR2A和NR2B受体在WT和FMR1KO小鼠ACC区的表达水平都没有显著性差异。因此，mGluR5和D1受体在ACC区突触增强作用受损不是因为mGluR5和D1受体以及NR2A和NR2B受体的基础表达水平差异引起的。且单独使用SKF81297或者SKF81297联合使用DL-AP3都不影响NR2A和NR2B亚型在FMR1WT和KO小鼠PFC神经元上的表达。然而，单独使用SKF81297或者SKF81297联合使用DL-AP3都显著性增加了NR2B亚型磷酸化位点Tyr-1472(p-NR2B-Tyr1472)在FMR1WT小鼠PFC培养神经元上的表达。同时，单独使用SKF81297没有增加NR2B亚型磷酸化位点Tyr-1472(p-NR2B-Tyr1472)在FMR1KO小鼠PFC培养神经元上的表达。而SKF81297联合使用DL-AP3能恢复SKF81297在FMR1KO小鼠PFC培养神经元上p-NR2B-Tyr1472的表达增加作用。7SKF81297与DL-AP3联合效应对FMR1KO小鼠行为学的影响通过行为学研究发现，FMR1KO小鼠的自发活动能力增加。腹腔注射SKF81297或者SKF81297联合使用DL-AP345分钟后，FMR1WT小鼠的自发活动的运动距离都没有显著性改变。然而，单独腹腔注射SKF81297或者SKF81297联合使用DL-AP345分钟后，FMR1KO小鼠自发活动的运动距离都有显著性降低。在模拟焦虑行为的高架十字实验中我们发现，FMR1KO与WT组小鼠以及单独应用SKF81297或联合使用DL-AP3组之间焦虑指标没有显著性差异，表明脆性X综合症模型小鼠没有表现出焦虑样行为，且焦虑样行为很可能不是通过D1受体通路起作用的。.小鼠每天单独腹腔注射SKF81297或者SKF81297联合使用DL-AP35周后，进行Morris水迷宫实验。对此后4天FMR1KO和WT小鼠找到平台所用时间分析发现，在第一天两组之间就有显著性差异，FMR1KO组比WT组小鼠找到平台所用时间长。单独使用SKF81297或DL-AP3均不影响FMR1KO和WT小鼠找到平台所用时间，联合使用SKF81297和DL-AP3在前3天与同基因型组相比没有显著改变，而在第4天，FMR1KO小鼠与联合用药的FMR1KO小鼠组相比有显著性差异，联合使用SKF81297和DL-AP3在第四天显著降低FMR1KO小鼠找到平台所用时间。FMR1KO和WT小鼠在水迷宫实验过程中的平均游泳速度在组间没有显著性差异。8FMR1KO小鼠ACC区五羟色胺能突触可塑性异常为了明确FMR1KO小鼠ACC区除多巴胺系统外，其他有关突触可塑性的递质系统是否正常，我们检测了5-HT2A系统在ACC区有关突触可塑性的电生理学和分子生物学表现。我们发现使用5-HT2A受体拮抗剂的WT小鼠能增强LTP效应。然而，5-HT2A受体拮抗剂在FMR1KO没有表现出对LTP的增强效应。电生理实验表明，与多巴胺系统在FMR1KO小鼠ACC区突触可塑性功能受损类似，五羟色胺能系统在FMR1KO小鼠ACC区调节突触可塑性的功能也是受损的。.我们在灌流液中加入NMDA受体拮抗剂AP5(50μM)，发现R-96544(5μM)介导的在FMR1WT小鼠LTP增强效应消失。通过双脉冲易化(PPF)表现，发现在FMR1WT和FMR1KO小鼠ACC区，在灌流液中加入R-96544(5μM)前后，PPF的五个脉冲间隔产生的突触后反应没有显著性差异。结果表明，突触前递质释放没有改变，R-96544介导的可塑性很可能是经由突触后机制产生的。为进一步明确FMR1KO小鼠五羟色胺能受体调节LTP功能受损的机制，我们检测了5-HT2A受体在WT和FMR1KO小鼠ACC区的表达情况，发现5-HT2A受体以及NMDA受体的两个亚型NR2A和NR2B受体在WT和FMR1KO小鼠ACC区的表达水平都没有显著性差异。5-HT2A受体在ACC区突触增强作用受损不是因为5-HT2A受体以及NR2A和NR2B受体的基础表达水平差异引起的。我们在培养的PFC细胞中加入5-HT2A受体拮抗剂R-96544，发现，在培养液中有1μM五羟色胺的情况下，使用R-96544(5μM)会增加培养的FMR1WT小鼠PFC神经元膜上GluR1的表达。表明5-HT2A受体拮抗剂能增强FMR1WT小鼠PFC细胞GluR1受体在膜上表达，而这种增强作用在FMR1KO小鼠消失，表明FMRP在五羟色胺调控GluR1受体在膜上表达的过程中起着重要作用。