背景: 器官移植随着外科手术、免疫抑制药物及移植免疫学基础的迅速发展，已成为许多器官功能衰竭终末期的有效的治疗手段。但是阻碍其发展的最大障碍之一是移植排斥反应。免疫学认为解决这个问题的方法关键之一就是诱导免疫耐受。然而，由于这方面的理论基础仍未得到很好的阐明，所以研究免疫耐受的机制有着重大的意义。肝脏移植被认为是相对于其他器官，如肾脏、心脏、胰腺等脏器的移植更易于接受。越来越多的学者都赞同肝脏实质上是一个特殊的免疫器官。事实上，肝脏内的免疫微环境确实比较复杂。因此，研究和认识肝内局部免疫反应的调控和免疫耐受机制将会有很大的应用前景，如在认识自身免疫病和器官移植排斥方面等。越来越多的实验证据表明，肝内的APC在介导免疫耐受起着关键的作用，其中最有潜质的是肝窦内皮细胞（HSEC），HSEC有着战略的解剖位置及结构、独特的免疫表型、特异的免疫功能，重要地，能提呈外源性抗原给CD4和CD8阳性的T细胞，并诱导其转化成一个耐受的表型。这些特性似乎暗示着HSEC在诱导肝脏局部免疫耐受中起着关键的作用。本课题组前期实验已经发现肝内的几种抗原提呈细胞（包括kupffer、DC、HSEC）都能识别与吞噬凋亡细胞，其中HSEC能快速地与凋亡细胞识别并将其吞噬，产生一系列的免疫学作用，同时本课题组还发现了肝脏是凋亡细胞主要的“归巣”地。另外，已经发现肝脏移植物进入机体后，激活免疫细胞产生IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、IFN-γ等多种因子引起免疫排斥反应，因此微环境中细胞/化学因子在移植排斥早期诊断和鉴别诊断中起着重要的作用。在根据本课题组孙尔维等教授提出的“凋亡细胞能主动诱导免疫耐受”的假设基础上，本课题研究设想，循环的凋亡细胞从循环中进入肝脏后，与肝内的APC相互作用会发生一系列的免疫学事件，而其中在免疫特性中比较突出的HSEC与凋亡细胞作用后在诱导肝脏局部免疫耐受起着关键作用。为此，本研究主要通过体外HSEC与同种异体的凋亡淋巴细胞相互作用，观察其分泌细胞因子/化学因子水平的变化，判断其免疫反应的偏向，初步探讨其诱导免疫耐受的免疫学机制。本研究内容总结为以下三部分： 第一章、人肝窦内皮细胞的培养及传代。 目的： 建立人原代肝窦内皮细胞培养传及代技术，为下一步实验打下基础。 方法： 购自ScienCellTM Research Laboratories的人原代肝窦内皮细胞，经过复苏后，运用特殊的内皮细胞专用培养基进行培养。肝窦内皮细胞在铺有纤维连接蛋白的培养瓶上贴壁生长，复苏后的细胞第2天换液去除DMSO和死亡的细胞，以后每隔2天换一次液，细胞融合90%左右开始传代，传代时应用0．02%胰酶/EDTA混合液消化细胞，纯胎牛血清终止消化。 结果： 肝窦内皮细胞在传代后3h左右开始贴壁，胞体逐渐变长，培养的肝窦内皮细胞相差光学显微镜下呈“鹅卵石样”或“纺锤形”，胞浆没有颗粒。细胞数量在2-3天后一般双倍增殖。 结论： 肝窦内皮细胞体外分离操作步骤复杂、存活率非常低，而且体外培养条件十分苛刻，不能作为长期培养。一般传了15代的细胞失去了活性。培养肝窦内皮细胞一般需要专用的培养，其主要特点是含有内皮生长因子（VEGF）和低浓度血清。本实验证明在内皮生长因子VEGF和低浓度血清条件下，肝窦内皮细胞生长形态良好，为下一步研究打下了良好的基础。 第二章、人外周血淋巴细胞凋亡的诱导及检测。 目的： 凋亡细胞在体内很快地被清除，体外凋亡细胞也不能长期稳定。目前体外诱导凋亡细胞的技术虽然有了很大的进步，但是获得稳定、高纯度的凋亡细胞还是十分困难的。建立诱导人外周血淋巴细胞凋亡技术，获取人外周血凋亡的淋巴细胞，为下一步研究提供平台。 方法： （1）凋亡细胞的诱导：抽取健康人外周血，抗凝稀释后，人淋巴细胞分离液密度离心法分离获得人外周血单个核细胞，然后贴壁培养去除贴壁细胞，留取悬浮细胞即为人外周血淋巴细胞（PBL）。PBL调整细胞数后，重悬于含10%胎牛血清的PRMI1640培养基，距离UVB紫外灯10cm，振荡条件下辐射10min，然后CO2孵箱培养10h，收集的细胞即为凋亡细胞。 （2）细胞凋亡率的检测：收集的凋亡细胞，取1×105细胞数，Annexin-Ⅴ-FITC/PI双染色，1h内上流式检测凋亡率。 结果： 经过流式检测的人外周血淋巴细胞凋亡率平均48%，几乎都是早期凋亡，晚期凋亡和坏死细胞占少数。 结论： 本实验室摸索的UVB紫外线辐射诱导凋亡为物理因素导致的细胞凋亡，其方法简便，经济、可重复性较高，可以作为一种体外研究凋亡细胞的一种技术方法。流式细胞术作为一门生物检测技术已经日臻完善，检测凋亡/坏死细胞表面表达的分子作为判断凋亡率和坏死率比传统的方法更加方便、省时，且区别凋亡和坏死更准确。本实验诱导的凋亡率与其他文献报道的相似，这为下一步研究提供了一个很好的平台。 第三章、肝窦内皮细胞与凋亡细胞相互作用对细胞因子分泌水平的影响。 目的： 观察肝窦内皮细胞与凋亡细胞相互反应后，对细胞因子分泌水平的影响。从而了解免疫反应的方向及在凋亡细胞作用后，肝窦内皮细胞所产生的免疫微环境情况，初步探讨肝内局部免疫耐受的免疫学机制。 方法： （1）肝窦内皮细胞的培养和获得凋亡淋巴细胞。具体方法见第一、二章。 （2）细胞共培养体系及实验分组。空白组：HSEC；对照组：HSEC+Livinglymphocytes（1：2）；实验组：HSEC+Apoptotic lymphocytes（1：2）。上述三组共培养体系培养时间为16 h，收集上清，离心后留取上清液，-20℃保存待测。 （3）Luminex技术检测细胞因子水平。上述上清液恢复室温，依据Bio-PlexTMhuman cytokine 17-plex panel说明书操作，依次加入Anti-cytokine conjugated Beads、稀释的上清液、Detection Antibody、Streptavidin-PE反应。立即上Bio-Plex 200 System检测细胞因子分泌水平。 （4）所用数据利用SPSS13．0软件处理。空白组和对照组、空白组和实验组都应用One-WayANOVA方法进行统计学分析。 结果： 空白组与对照组的IL-6、GM-CSF、TNF-α、MIP-1β的浓度水平没有差异性（p>0．05）；实验组相对与空白组的差异有统计学意义（p<0．05），对与IL-2和IFN-γ则没有。而IL-10、IL-7、IL-13在三组中几乎是不分泌的。 结论： 本实验通过体外人HSEC与同种异体的凋亡淋巴细胞反应后，利用Luminex技术观察其培养体系分泌到上清液的IL-6、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ、MIP-1、IL-2、IL-10、IL-7、IL-13水平的变化，IL-6、GM-CSF、TNF-α、MIP-1β这些细胞因子属于炎症性细胞因子，在介导免疫排斥方面起着重要的作用，发现其分泌水平在实验组中都显著下调。IL-10主要由Th2细胞产生，主要生物活性是抑制巨噬细胞的抗原提呈功能；抑制多种促炎细胞因子的产生；抑制Th1细胞的应答等。有报道在体内肝脏IL-10能被测到，但是本实验却没有见到分泌，这提示HSEC是不分泌IL-10，可能在肝内是另有其他的APC分泌，具体机制需要进一步研究。IL-7、IL-13却在各组中没有分泌，IL-7主要是由骨髓基质细胞和胸腺细胞分泌，IL-13主要由细胞活化的T细胞分泌，这两种细胞因子都没有检测到，结果符合预期设想。然而，在空白组和实验组中这些细胞因子的分泌水平是没有显著差异的（P>0．05），说明肝窦内皮细胞与活细胞的相互作用对细胞因子水平的分泌是没有影响的。因此，所用这些数据说明了HSEC与凋亡细胞作用后能显著下调促炎症因子的分泌。对此，本实验推测HSEC在肝内与凋亡的细胞相互作用调控局部特殊微环境，例如调控细胞/化学因子等，产生某些信号事件（如耐受T效应细胞或增加Treg的比例等），从而使免疫发生偏向，产生耐受特性。