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抑制microRNA-21表达降低结肠癌侵袭转移能力的实验研究本课题采用质粒载体miRZip21转染结肠癌细胞系抑制其内源性microRNA-21的表达,并通过体内和体外实验检测microRNA-21靶向基因：TIMP-3, RECK, BMPRII和PCDH17的mRNA和蛋白的表达水平以及肿瘤生物学行为的改变,探讨microRNA-21影响结肠癌侵袭机能的作用机制。第一部分不同人结肠癌细胞系microRNA-21表达水平的实验研究目的通过培养不同人结肠癌细胞系,检测microRNA-21的表达水平,筛选抑制microRNA-21的目标细胞系。方法培养不同人结肠癌细胞系SW480、SW620、HCT-116和LoVo,应用荧光探针法检测microRNA-21和内参U6的Ct值,计算相对microRNA-21的相对表达量。结果各细胞系生长特性不同,microRNA-21的表达水平也不同,SW480表达水平最高,HCT-116和LoVo表达次之,SW620细胞表达最低。结论(1)不同结肠癌细胞系microRNA-21表达水平不同,由原发肿瘤建立的细胞系SW480和HCT-116的microRNA-21表达水平高于肿瘤转移灶建立的细胞系SW620和LoVo。(2)由于SW480缺乏与转移相关的一种金属蛋白酶,HCT-116细胞系是本课题研究结肠癌侵袭转移能力的理想对象。第二部分抑制microRNA-21影响结肠癌侵袭转移能力的体外研究目的通过抑制人结肠癌细胞系HCT-116microRNA-21的表达,观察HCT-116细胞在体外环境下转移相关基因转录和蛋白表达,肿瘤细胞迁移和侵袭能力的变化。方法(1)应用能够稳定表达反义microRNA-21的miRZip21质粒,转染HCT-116细胞系,检测microRNA-21的变化；(2)通过TargetScan和PicTar等工具筛选与转移侵袭相关的microRNA-21靶基因；(3)采用实时定量PCR方法检测转染前后靶基因mRNA的转录变化；通过Western Blotting方法检测靶基因蛋白表达水平的变化；(4)通过平皿划痕实验和Transwell实验观察抑制microRNA-21前后HCT-116细胞转移和侵袭能力的变化。结果(1)用miRZip21质粒转染结肠癌细胞系HCT-116后,microRNA-21的农达水平下降约40%。(2)通过TargetScan和PicTar等工具筛选出四种与转移侵袭相关的nicroRN A-21靶基因：TIMP-3、RECK、BMPRII和PCDH17；(3)抑制microRNA-21后,TIMP-3、RECK、BMPRII和PCDH17的mRNA分别上调为原来的2.3倍、2.7倍、1.3倍和1.2倍,其中TIMP-3和RECK上调具有明显统计学差异(P<0.05)。Western Blot结果显示TIMP-3上升约3.5倍,RECK上升约2倍,具有统计学意义(P<0.05)。(4)划痕实验结果表明抑制microRNA-21后,HCT-126细胞的转移能力明显减弱。(5)Transwell实验结果显示microRNA-21抑制后,24小时和48小时侵袭结果具有明显差异(P<0.05)。结论(1)应用质粒miRZip21体外转染结肠癌细胞系HCT-116可以一定程度的抑制microRNA-21的表达。(2)microRNA-21具有多个靶基因；抑制microRNA-21后,与抑制肿瘤转移相关的靶基因TIMP-3和RECK的mRNA及其蛋白表达均有不同程度的上调,结果表明microRNA-21对靶基因存在mRNA和蛋白两个层面的调控。(3) microRNA-21对多个靶基因的抑制作用强弱并不相同,其抑制程度可能与其对靶基因结合过程中匹配程度密切相关。(4)抑制nicroRNA-21的表达能够减弱结肠癌细胞HCT-116在体外的侵袭和转移能力。第三部分抑制microRNA-21影响结肠癌侵袭转移能力的体内研究目的建立人结肠癌HCT-116细胞系裸鼠异位种植瘤模型,通过抑制microRNA-21表达,观察结肠癌异位种植瘤在动物体内生物学行为的变化。方法(1)选用4-6周龄BALB/c-nu雌性裸鼠,分2组建立结肠癌种植瘤动物模型：A组(miRZip21体外转染组)：在左大腿内侧皮下种植体外已转染miRZip21质粒的结肠癌HCT-116细胞；B组(体内转染组)：在左大腿内侧皮下种植结肠癌HCT-116细胞；(2)当B组种植瘤体积达到60mm3左右时随机分为3组：B1(体内转染质粒miRZip21组),B2(体内转染对照质粒Leti3组)和B3(空白对照组),按实验设计对B1和B2组分别用质粒miRZip21和Leti3进行裸鼠体内转染；A和B3组不作处理。观察种植瘤生长及转移情况,观察时间为6周；(3)6周后处死动物观察肿瘤生长及体内转移状况；采集肿瘤标本,检测microRNA-21的表达情况,并通过病理组织学观察靶基因蛋白TIMP-3和RECK的表达。结果(1)采用皮下注射结肠癌细胞的方法可以成功建历肠癌种植瘤动物模型,成瘤率100%；(2)体外与体内转染miRZip21质粒组在转染开始后三周时种植瘤生长体积相似(P>0.05)；在肿瘤种植初期和后期,体外转染组肿瘤体积均小于体内转染组(P<0.05)。(3) miRZip21体外、体内转染组与对照质粒组、空白对照组相比生长明显减慢,种植瘤体积小于对照质粒组和空白对照组(P<0.05, P<0.05);(4) miRZip21体外转染组和体内转染组肿瘤组织microRNA-21表达水平相似(P>0.05),低于空白对照组和对照质粒组表达水平(P<0.05,P<0.05)；(5)解剖发现对照质粒组(5/8)和空白对照组(6/8)瘤体所在部位腹股沟区肿大淋巴结多于miRZip21质粒体外转染组(3/8)和体内转染组(3/8)；部分空白对照组(3/8)和对照质粒组(2/8)可见腹腔肿大淋巴结,miRZip21质粒体外和体内转染组未见腹腔肿大淋巴结,4组动物均无肝脾肿等脏器癌灶转移；免疫组化结果显示miRZip21体外转染组和体内转染组较对照质粒组和空白对照组TIMP-3和RECK蛋白表达显著增强(P<0.05)。结论(1)局部皮下注射结肠癌细胞能成功建立裸鼠异位结肠癌种植瘤模型,是一种方便有效的造模方法。(2)通过抑制结肠癌种植瘤microRNA-21的表达可以抑制肿瘤生长,说明microRNA-21的靶基因中还可能存在与肿瘤增殖相关的基因。(3)局部体内转染miRzip21质粒可以达到与种植前体外转染瘤细胞相似的结果,说明miRZip21质粒能够作为基因治疗基础和临床研究的良好载体。(4)通过抑制microRNA-21的基因治疗,可以减缓肿瘤的增殖速度,一定程度提高肿瘤转移抑制基因TIMP-3和RECK的表达,抑制肿瘤转移。(5)抑制microRNA-21表达影响肿瘤结肠癌侵袭转移能力的体内实验结果与体外实验结果一致。(6) microRNA-21可以作为结肠癌抗肿瘤治疗的候选靶点。