研究背景对犯罪现场的可疑生物检材进行组织来源鉴定,是侦查活动中的重要环节之一。近年来,利用DNA甲基化作为遗传标记进行法医学人体组织/体液来源鉴定成为法医学领域新的研究热点。有研究证实,生物体基因组中存在大量的组织特异性甲基化区(tDMRs),由此赋予了不同组织细胞具有指纹般特异性的甲基化谱,通过比对这些特异性甲基化模式,理论上可以区分不同的组织和细胞。相比较传统的生化方法以及基于mRNA或micro RNA的组织来源鉴定方法,DNA甲基化标记法具有特异性好、稳定性高、不需消耗额外样本、能够与DNA分型技术相兼容等优势。随着DNA甲基化检测技术的不断发展,利用DNA甲基化标记鉴定组织来源的方法也越来越成熟,但现阶段各类研究所筛选出的位点数量有限且大部分位点仅对精斑检材有较好的特异性,故还远远不能满足法医实践中识别多种组织来源的需要。因此,有必要筛选更多的适用于各种组织鉴定的DNA甲基化差异性标记,增加不同组织细胞DNA甲基化模式的复杂程度,丰富该遗传标记的多态性。目的在全基因范围内筛选可用来鉴定精液、唾液等体液的DNA甲基化差异位点,为组织/体液鉴定寻找新的甲基化遗传标记提供参考。方法以日常法医接触较多的生物检材血液、唾液、精液、肌肉作为研究样本,采用有机法提取样本基因组DNA。利用甲基化敏感限制性内切酶HpaⅡ对样本DNA进行差异性酶切,酶切后的片段连接RHpa接头,PCR扩增得到差异性酶切片段的扩增子。以这些扩增子作为各组织样本基因组的“代表”进行消减杂交比较:以精液基因组DNA的扩增子作为Tester,其他3种组织体液样本的扩增子作为Driver,将连接上JHpa接头Tester与过量无接头的Driver混合进行第一次正向消减杂交,再将第一次杂交获得的差异片段接头转换为NHpa接头后进行第二次正向消减杂交,经过2次正向消减杂交即可富集精液相对其他3种样本的差异甲基化DNA靶片段。以其他3种组织体液样本的酶切产物扩增子作为Tester,精液基因组DNA的酶切产物扩增子作为Driver,进行2次反向消减杂交获得其他3种组织体液样本相对精液的差异甲基化DNA靶片段。将Tester和Driver分别改换为唾液和其他3种组织体液的基因组DNA,以同样方法进行唾液组织正反向消减杂交,完成唾液相对其他3中样本的差异甲基化DNA片段的消减杂交富集。对以上消减杂交富集得到的差异甲基化片段进行回收、纯化、克隆、测序,利用BLAST软件检测测序结果并进行靶片段基因组定位,再利用BSP技术对靶片段区域的甲基化进行定量分析明确靶片段多重CpG位点的甲基化程度,进一步筛选片段中具有组织/体液特异性的甲基化差异位点并进行多样本验证。结果利用MS-RDA方法初步筛选出6条精液特异性甲基化差异候选靶片段(Se-1~Se-6)以及6条唾液特异性甲基化差异候选靶片段(Sa-1~Sa-6),经过BSP验证:?在6条精液特异性甲基化差异候选片段中,Se-3靶片段中的CpG位点CpG11、CpG12、CpG13、CpG16、CpG17、CpG18在精液和血液样本中无甲基化修饰,在唾液样本中有低甲基化修饰(甲基化水平:0.1~0.17);Se-5靶片段中的CpG位点CpG2、CpG3、CpG6、CpG16、CpG9在精液和唾液样本中无甲基化修饰,在血液样本中有低甲基化修饰(甲基化水平:0.1~0.3);Se-6靶片段CpG位点中的CpG2、CpG5、CpG6、CpG8、CpG11、CpG13、CpG17、CpG18在精液样本中无甲基化修饰,在血液样本和唾液样本中均存在高甲基化修饰(甲基化水平:0.5~0.7)。?在6条唾液特异性甲基化差异候选片段中,Sa-1靶片段中的CpG位点CpG1、CpG4、CpG6、CpG7、CpG8在唾液样本中表现为完全甲基化修饰,在血液以及精液样本中有较高甲基化修饰(甲基化水平:0.7~0.9);Sa-6靶片段各CpG位点在唾液样本和血液样本中均表现出高甲基化修饰(甲基化水平:0.9),在精液样本中表现为低甲基化修饰(甲基化水平:0.1)。结论实验初步筛选出具有精液特异性非甲基化修饰特点的CpG位点以及具有唾液特异性高甲基化水平的CpG位点,可为识别精液样本和唾液样本提供有效的甲基化标记,为建立多态性高、特异性好的DNA甲基化鉴别法医学组织/体液来源方法提供更多的参考。