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高血压,血容量增加,局部心肌缺血损伤或先天性心肌疾病等均可导致局部或整体的心肌细胞负荷增加,心肌细胞受过度牵拉作用导致的机械刺激可发生适应性的代偿反应一心肌肥厚。心肌肥厚即是心律失常和猝死的危险因素,也可导致随后发生的心肌缺血和心衰反应。目前,对于机械刺激诱导的心肌肥厚反应并没有明确有效的治疗方法,且其发生机制尚不完全清楚。目前有观点认为,机械刺激可促进心肌细胞,心肌成纤维细胞或血管内皮细胞等分泌一系列促进细胞增生和肥大反应的生物活性物质,如血管紧张素II,内皮素,缓激肽等。这些生物活性物质中有很大一部分为G aq受体的激动剂,可以通过激活细胞内G aq受体信号通路进而影响细胞基因的表达和蛋白的合成。这种自分泌/旁分泌的作用被认为是机械刺激诱导心肌肥大反应过程中的一个重要机制。有证据表明,Caveolae可感受细胞外的机械刺激并在心肌肥大的发生发展过程中起了重要的作用。我们的前期研究结果表示Gaq蛋白及其偶联的受体可能位于Caveolae结构中,且Caveolae可影响G aq受体介导的细胞内信号转导通路的活性。 因此,本研究拟探讨机械刺激对Caveolae及Gaq信号通路的直接作用,观察机械刺激除通过自分泌/旁分泌机制间接作用于细胞内的G aq信号通路外,可否通过Caveolae直接影响细胞内的G aq信号通路,介导下游基因的表达和蛋白的合成。 实验一机械刺激对Caveolae结构和G蛋白与Caveolin蛋白共定位的影响 目的:观察机械刺激对细胞膜表面Caveolae结构和G蛋白与Caveolin蛋白共定位的影响。 方法:使用不同渗透压的Hank’s平衡盐溶液(Hank’s Balanced Salt Solution,HBSS)分别处理正常的A10细胞,Caveolin-1基因敲除的A10细胞和Caveolae结构被甲基-P-环糊精(Methyl-P-Cyclodextrin,mpCD)破坏的A10细胞,观察机械刺激对细胞直径的影响。使用焚光共振能量转移技术(Fluorescence Resonamce Energy Transfbr,FRET)和光漂白后焚光恢复技术(Fluorescence Recovery after Photobleaching,FRAP)观察机械刺激(150m0sm低渗刺激)对Caveolae结构的影响。随后米用FRET技术,焚光寿命成像技术(Fluorescence Lifbtim e Imaging Microscopy,FLIM)和免疫荧光(Immunofluorescence,IF)染色技术观察机械刺激对细胞膜表面蛋白G a q蛋白和恥肾上腺素受体(P2-adrenergic receptor,P2-AR)与Caveolin蛋白间共定位的影响。 结果:正常A10细胞在90 mOsm时出现具有统计意义的细胞直径的变化, Caveolin-1基因敲除的A10细胞和Caveolae结构被mpCD破坏的A10细胞分别在135 mOsm和120m0sm出现具有统计意义的细胞直径的变化,说明A10细胞在Caveolae结构消失后对机械刺激的作用更加敏感。机械刺激可减少A10细胞膜表面GFP-Caveolin-1蛋白与 mCherry-Caveolin-1蛋白间的FRET值,使 Caveolae结构内C aveolin-1蛋白间的距离增加。机械刺激不影响A10细胞膜表面转染的GFP-Caveolin-1蛋白的FRAP结果,但可使Alexa Fluor-488标记的A10细胞膜表面内源性Caveolin-1蛋白的FRAP速率增加,时间变短。说明机械刺激可增加细胞膜表面Caveolae的直径,并改变其主要结构蛋白Caveolin-1的构象。Gaq蛋白与Caveolin蛋白间存在共定位现象,且机械刺激可使A10细胞和狗原代心室肌细胞膜表面Caveolin-1/3蛋白与Gctq蛋白间的距离增加,共定位减少,FRET值降低。但A10细胞膜表面[32-AR受体与Caveolin-1蛋白间不存在FRET现象,且不受机械刺激的影响。这说明机械刺激可特异性影响细胞膜表面部分G蛋白与Caveolin蛋白的共定位。结论:Caveolae可缓冲机械刺激对细胞形态和体积的影响;机械刺激可破坏细胞膜表面Caveolae的正常结构,改变Caveolin-1蛋白的构象,增加Caveolae的直径;进而影响细胞膜表面Gaq蛋白与Caveolin蛋白间的距离。 实验二机械刺激对细胞膜表面Caveolae结构及其相关蛋白共定位的超清晰显微成像研究 目的:观察缓激肽受体B2受体(Bradykinin Receptor B2,B2R),Gaq和G a i蛋白在Caveolae结构内的定位以及机械刺激对其的影响。 方法:采用随机光学重建显微技术(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy, STORM)观察A IO细胞膜表面Caveolae的结构以及机械刺激对其结构的影响,使用Image J软件分析所得到的图像,比较机械刺激对A10细胞膜表面Caveolae直径和形态的影响。采用超清晰显微成像技术STORM观察A10细胞膜表面B2R,Gaq和Gai蛋白与Caveolin-1蛋白的共定位关系以及机械刺激对其的影响。使用Anaconda软件分析所得到的图像,比较机械刺激对A10细胞膜表面Caveolin-1蛋白与B2R,Gaq和Gai蛋白间的距离分布直方图,以及机械刺激对其的影响,随后将所得到的图像使用Im ageJ软件进行最近邻点距离(NeajestNeighborDistance,NND)分析,比较A10细胞膜表面Caveolin-1,B2R,Gaq和G ai蛋白的分布及机械刺激对其的影响。 结果:Caveolae为细胞膜表面50?100 n m大小的凹陷结构,机械刺激可增加Caveolae的直径,改变Caveolae的形态,但不释放Caveolin-1蛋白。机械刺激可增加B2R受体和G aq蛋白与Caveolin-1蛋白分子间的距离,使B2R受体和G aq蛋白与Caveolin-1蛋白间距离分布直方图的峰值右移,但不影响G a i蛋白与Caveolin-1蛋白间的距离。Caveolin-1蛋白在细胞膜表面的分布集中在40nm左右的范围内,机械刺激可使Caveolin-1蛋白的分布曲线右移。而B2R受体,Gaq蛋白和G a i蛋白在细胞膜表面的分布集中在80 n m左右的范围内,且机械刺激对其分布影响不明显。 结论:B2R,Gaq和Gai三种蛋白均可位于Caveolae结构中,机械刺激使B2R受体和G a q蛋白与Caveolin-1蛋白间的距离增加,但不影响Gai蛋白与Caveolin-1蛋白间的距离。 实验三机械刺激对细胞膜表面受体的运动和寡聚化状态的影响 目的:观察机械刺激对细胞膜表面Caveolin-1蛋白,B2R和恥-AR受体分布,运动以及寡聚化状态的影响。 方法:采用Z-stack扫描技术,观察A10细胞膜表面Caveolin-1蛋白,B2R和p2-AR受体的分布以及机械刺激对其的影响。使用焚光相关光谱技术(Fluorescence CorrelationSpectroscopy,FCS),观察A10细胞膜表面B2R受体和P2-AR受体的运动情况以及机械刺激对其的影响。将所得到的FCS数据进行光子计数直方图(Photon CountHistogram,PCH)分析,观察A10细胞膜表面B^R受体和p2-AR受体的寡聚化状态以及机械刺激对其的影响。 结果:Caveolin-1蛋白,B2R受体和R-AR受体均集中于A10细胞的基底细胞膜,在顶端细胞膜的分布较少,机械刺激可促进Caveolin-1蛋白和[32-A R受体向顶端细胞膜移动,但不影响B2R受体在细胞膜表面的分布。B2R受体和p2-A R受体在A10细胞膜表面的运动均可分为两组,一组受体在细胞膜表面的运动较快,另一组受体在细胞膜表面的运动较慢,在A10细胞的顶端细胞膜和底端细胞膜均可观察到这种现象,且机械刺激不影响A10细胞膜表面B2R受体和[32-AR受体的运动能力。此外,B2R受体和h-AR受体在A10细胞膜表面均可以单聚体和寡聚体两种形式存在,在A10细胞的顶端细胞膜和底端细胞膜均可观察到这种现象,且机械刺激不影响A10细胞基底细胞膜和顶端细胞膜B2R受体和恥-AR受体的寡聚化状态。 结论:机械刺激促进Caveolin-1蛋白和恥-AR受体向顶端细胞膜移动,但不影响B2R在细胞膜表面的分布;机械刺激不影响B2R受体和恥-AR受体在A10细胞膜表面的运动和寡聚化状态。 实验四机械刺激对G蛋白介导的细胞内信号通路的影响 目的:观察机械刺激对G蛋白介导的细胞内信号通路的影响 方法:采用妈离子特异性焚光标记物Fura-2和Calcium Green记录A10细胞内Gaq-PLCp_Ca2+信号通路对 M型胆碱能受体(Muscajinic Acetylcholine Receptors, mAchRs)激动剂Carbachol的反应,以及机械刺激对其的影响。同时观察Carbachol对Caveolim-1基因敲除的A10细胞和Caveolae结构被mpCD破坏的A10细胞内Gaq-PLCP-Ca2+信号通路的影响。采用钙离子荧光标记物Fum-2记录A10细胞内Ca2+浓度对细胞外生长因子刺激的反应,以及机械刺激对其的影响。采用cA M P探针ICUE3,观察[3肾上腺素受体激动剂Isoprenaline对细胞内Gas/God-AC-cAMP信号通路的影响,以及机械刺激对其的影响。 结果:机械刺激可减弱Carbachol诱导的A10细胞内Gaq-PLCp_Ca2+信号通路的激活,Caveolin-1基因敲除或Caveolae结构破坏具有同样的作用,也可减弱Carbachol诱导的A10细胞内Gaq-PLCP-Ca2+信号通路的激活,且Caveolin-1基因敲除后,机械刺激对Carbachol诱导的细胞内Gaq-PLC]3-Ca2+信号通路无影响。与 Carbachol诱导的细胞内Ca2+反应相比,生长因子诱导的细胞内Ca2+反应速度较慢,幅度较小,且对机械刺激无影响。与Carbachol诱导的细胞内Ca2+反应相比,Isoprenaline诱导的细胞内cAMP反应速度较慢,持续时间较长,且不受机械刺激的影响。 结论:机械刺激可减弱Carbachol诱导的细胞内Gaq-PLC)3-Ca2+信号通路的激活,但不影响生长因子诱导的细胞内Ca2+反应和Isoprenaline诱导的细胞内Gas/Gai-AC-cAMP信号通路的变化。 小结: 通过以上四部分实验,我们发现机械刺激可改变细胞膜表面Caveolae的结构,增加Caveolae的直径,减少Caveolin蛋白与G aq蛋白及其相关受体间的相互作用,进而减弱细胞内mAchRs受体激活诱导的Gaq-PLCP-Ca2+信号通路。但机械刺激并不影响生长因子诱导的细胞内Ca2+反应和Isoprenaline诱导的细胞内Gas/Gai-AC-cAMP信号通路的改变,且对细胞膜表面B2R受体和P2-A R受体的运动和寡聚化状态无影响。