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实验目的对刚地弓形虫peroxiredoxin(TgPrx)基因进行克隆、表达、纯化,分析其免疫原性,观察TgPrx免疫小鼠诱导的黏膜及系统免疫应答及其抗弓形虫感染的能力,探讨TgPrx作为弓形虫疫苗候选抗原的可能性。实验方法第一部分:构建重组质粒pET30a/TgPrx,并在大肠杆菌中高效表达可溶性蛋白。收集、纯化RH株弓形虫速殖子,提取总RNA;设计合成引物并引入EcoR I和Xho I酶切位点,RT-PCR扩增编码TgPrx的基因片段克隆到原核质粒pET30a中,经双酶切、PCR及测序鉴定阳性克隆;在大肠杆菌BL21/DE3中用IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE进行鉴定。第二部分:对原核系统表达的rTgPrx进行纯化、免疫原性分析并制备抗血清。大量表达rTgPrx可溶性蛋白,以Ni-NTA层析法纯化蛋白,用兔抗弓形虫血清做Westen blotting分析其免疫原性;以纯化的TgPrx皮下注射免疫Wistar大鼠,ELISA测定血清中抗体滴度;纯化的重组rTgPrx蛋白加入不同浓度的蛋白酶抑制剂——苯甲基磺酰氟(Phenylmethane sulfonyl fluoride,PMSF),观察该蛋白的降解情况;采用免疫组化方法,对Prx做初步定位。第三部分:观察不同剂量rTgPrx滴鼻免疫小鼠诱导的黏膜和系统免疫应答及抗弓形虫感染作用。BALB/c小鼠75只随机分为5组,免疫组分别用10μg、20μg、30μg、40μg rTgPrx/只滴鼻免疫小鼠3次,各间隔2周,rTgPrx溶于20μL PBS中,对照组用等量PBS滴鼻。末次免疫后第14 d,用1×104个速殖子/只灌胃攻击全部小鼠,观察小鼠健康状况。攻击后第30 d,眼静脉丛采血,颈椎脱臼处死小鼠,检测肠液IgA和血清IgG,计数肝、脑组织内弓形虫速殖子,分离并计数肠上皮内淋巴细胞(intestinal intraepithelial lymphocytes, IEL)及脾淋巴细胞。实验结果从弓形虫RH株cDNA中扩增出591 bp的TgPrx基因片段,并成功构建重组质粒pET30a/TgPrx;SDS-PAGE结果表明,目的基因在大肠杆菌BL21/DE3中高效表达,相对分子量(Mr)约32kDa,比预期值大约7kDa。Western blotting显示纯化后的rTgPrx能被兔抗弓形虫免疫血清识别;免疫大鼠后可诱导产生高滴度的特异性抗体,该蛋白在-20℃保存2周时开始降解,反复冻融可加速其降解;免疫组化结果显示大鼠抗TgPrx血清能特异性识别速殖子中的Prx,Prx分布部位呈棕色反应。攻击后第7～14 d,小鼠出现竖毛、倦怠、活动减少、饮水及采食减少等异常表现,10μg组和对照组小鼠死亡4只,20μg、30μg组死亡6只,40μg组死亡9只。40μg组肝、脑组织内虫荷(速殖子数)显著低于10μg、20μg、30μg组和对照组(P<0.05),40μg组血清IgG、IEL及脾淋巴细胞数量均高于对照组(P<0.05),肠液IgA无差异。结论成功构建重组质粒pET30a/TgPrx并在大肠杆菌中高效表达可溶性蛋白。原核系统表达的rTgPrx具有免疫原性。40μg组rTgPrx滴鼻免疫更有效诱导了黏膜和系统免疫应答,并有效抵抗弓形虫感染。