膀胱癌作为泌尿系统最常见的肿瘤之一,其在世界范围内恶性肿瘤中已居第九位,每年全球大约有近430000人被诊断出膀胱癌。然而,根据晚期膀胱癌相关化疗临床实验结果,其治疗效果仍比较局限。深入探索膀胱癌发生发展过程中的分子机制,寻求潜在的治疗靶点和通路,可为膀胱癌的诊断及治疗提供新方向。作为一类新发现的RNA分子,环状RNA(circ RNA)一度被认为是基因转录后错误剪接而产生的“副产品”。随着新一代测序技术的诞生及生物信息分析技术的发展,诸多研究发现circ RNA在哺乳动物细胞中广泛表达,并且具有组织、细胞、生长阶段、疾病发生发展等表达特异性。而且已有诸多报道证实,部分环状RNA在不同肿瘤中发挥着至关重要的作用。目前,我们通过高通量测序分析技术,首次发现环状RNA NR3C1(circ NR3C1,膀胱癌相关环状RNA-1,BCRC-1 Gen Bank号:KU921432.1)在膀胱癌组织中低表达,并通过实时定量分析证实了circ NR3C1在膀胱癌组织及细胞系中低表达。我们将通过体内外实验进一步研究circ NR3C1对膀胱癌的生物学功能影响;通过体外分子生物学实验技术深入探索circ NR3C1参与生物学调控的分子机制;通过其表达与临床指标的相关性研究,探讨其存在的潜在临床意义。本研究将主要从以下三个部分进行论述:第一部分CircNR3C1在人膀胱癌组织和细胞中的表达及其对膀胱癌生物学行为的影响实验目的:对circ NR3C1在人膀胱癌组织和细胞系中的表达进行分析,并进一步研究其在体内外对膀胱癌细胞生物学行为的影响。实验方法:1、通过PCR、Nortern Blot和Rnase R酶消化实验对膀胱癌细胞系中的circ NR3C1进行鉴定;2、采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)法检测42例膀胱癌组织标本及细胞系中的circ NR3C1表达水平,分析circ NR3C1的表达差异性与临床指标的相关性,并通过荧光原位杂交实验(FISH)对膀胱癌细胞系(EJ)中的circ NR3C1进行细胞定位分析;3、构建circ NR3C1过表达载体,建立circ NR3C1稳定表达细胞系,通过平板克隆、CCK-8(细胞计数试剂盒-8)、Ed U(5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷)、流式细胞周期检测、细胞侵袭和迁移实验研究circ NR3C1对膀胱癌细胞生物功能的影响;4、建立裸鼠的移植瘤模型,分析过表达circ NR3C1对移植瘤生长的影响。实验结果:1、CircNR3C1由基因NR3C1的第2个外显子头尾相接形成,其稳定存在于膀胱癌细胞中。2、膀胱癌组织中的circ NR3C1相对于其癌旁正常膀胱组织低表达;相对于正常尿路上皮细胞系SV-HUC-1,其在膀胱癌细胞系EJ、T24T和UMUC3中低表达;circ NR3C1组织表达差异性与临床指标无相关性;FISH实验证实了circ NR3C1主要分布于细胞浆。3、过表达circ RN3C1可明显抑制T24T细胞和EJ细胞的增殖,并诱导细胞G0/G1-S期阻滞;过表达circ NR3C1对细胞的侵袭和迁移并无明显影响。4、在裸鼠皮下移植瘤模型实验中,相对于对照组,过表达circ NR3C1组对移植瘤的生长有明显的抑制作用。实验结论:CircNR3C1在人膀胱癌组织和膀胱癌细胞系中低表达,且主要定位于细胞浆,过表达circ NR3C1可明显抑制膀胱癌细胞的增殖和膀胱癌在体内的生长。第二部分CircNR3C1通过下调cyclin D1蛋白的表达抑制膀胱癌细胞增殖实验目的:寻找circ NR3C1引起膀胱癌细胞增殖受到抑制的下游靶标,并进一步研究circ NR3C1调控靶标对膀胱癌生物学功能的影响。实验方法:1、对EJ和T24T进行circ NR3C1过表达,通过Western Blot检测周期蛋白CDK2、CDK4、CDK6、cyclin D1、cyclin E、P21和P27的蛋白表达,并分析表达差异性,确定差异性表达蛋白。2、通过流式细胞周期、western bolot逆转实验进一步确定circ NR3C1与cyclin D1的调控作用及其对细胞周期的影响;3、通过细胞平板克隆、Ed U逆转实验进一步验证circ NR3C1调控cyclin D1对细胞增殖的影响;4、通过免疫组织化学(IHC)分析人膀胱癌组织和小鼠移植瘤组织中cyclin D1表达情况,进一步在体内实验中证明circ NR3C1对cyclin D1的调控作用。实验结果:1、过表达circ NR3C1后周期蛋白cyclin D1的表达降低,而其他周期蛋白无明显变化。2、过表达cyclin D1可逆转circ NR3C1引起的细胞周期阻滞,可逆转cyclin D1蛋白的表达。3、过表达cyclin D1可逆转circ NR3C1的抑制细胞增殖的作用。4、免疫组化分析显示,在人膀胱癌组织中cyclin D1相对于正常膀胱组织高表达;在小鼠移植瘤组织中,相对于对照组(转染vector),cyclin D1在实验组(过表达circ NR3C1)中低表达。实验结论:CircNR3C1通过下调周期蛋白cyclin D1的表达,阻滞细胞由G0/G1向S期转变,抑制膀胱癌细胞增殖。第三部分CircNR3C1竞争性结合mi R-27a-3p下调cyclin D1蛋白表达抑制膀胱癌细胞增殖实验目的:深入探索circ NR3C1下调cyclin D1蛋白调控细胞周期和细胞增殖的分子机制。实验方法:1、设计circ NR3C1 FISH探针,并通过PCR和pull-down实验验证探针的有效性。2、通过查找数据库(主要是starbase、circinteractome),预测可能与circ NR3C1结合的mi RNA,并通过pull-down实验、Western Blot和FISH共定位进一步确定与circ NR3C1相互作用的mi RNA。3、通过细胞平板克隆形成实验、Ed U细胞增殖分析、流式细胞周期和wenstern blot逆转实验,进一步验证circ NR3C1对目的mi RNA的调控作用及二者相互作用对细胞增殖的影响。4、构建circ NR3C15’UTR(5’端非翻译区)的野生型和突变型荧光素酶报告载体,通过双荧光素酶报告分析明确目的mi NRA对cyclin D1调控机制。实验结果:1、生物素化的FISH探针,可有效并特异性富集circ NR3C1。2、circ NR3C1可竞争性结合内源性mi R-27a-3p和mi R-23-3p,同时干扰mi R-27a-3p表达可下调cyclin D1的表达,而干扰mi R-23a-3p的表达对cyclin D1的表达无显著影响。3、过表达circ NR3C1可逆转mi R-27a-3p的促细胞增殖作用,可逆转mi R-27a-3p上调cyclin D1蛋白表达的作用。4、mi R-27a-3p可作用于cyclin D1的5’UTR区,上调cyclin D1的表达。实验结论:CircNR3C1通过竞争性结合mi R-27a-3p,减少mi R-27a-3p与cyclin D15’UTR的结合,下调周期蛋白cyclin D1的表达,从而抑制膀胱癌细胞的增殖。