论文部分内容阅读
本研究以非维管植物地衣为分离材料,采用抗生素加醋酸钠热处理的方法,从48个地衣样本中分离到6株苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）,编号为BRC—ZQL1至BRC—ZQL6。为了解其生物学特性,分别对这6个菌株进行生理生化测定,结果显示:这些菌株在生理生化指标上都存在着一定差异。通过cry基因PCR—RFLP检测发现:6个菌株均含有cry1基因（cry1Ad、cry1Ba、cry1Cb、cry1Da、cry1Ea）;5个菌株含有cry2基因（cry2Ac、cry2Ah）;这些菌株还含有cry9、cry1I等基因。BRC—ZQL5、BRC—ZQL6菌株的PCR—RFLP图谱出现特异性片段,推测其存在新基因。选用BRC—ZQL1至BRC—ZQL6和实验室保存的3个菌株（Bt 8010、Bt HD1、Bt 010）,以不同浓度菌液对广州管圆线虫（Angiostrongylus cantonensis）进行杀虫活性初步鉴定,发现不同菌株毒性存在较大差异,其中BRC—ZQL3杀虫效果最好。提取BRC—ZQL3伴孢晶体蛋白对A. cantonensis进行生测,处理24 h和48 h的LC50分别为2.85415和1.10599 mg/mL,表明BRC—ZQL3对A. cantonensis具有较明显的杀虫活性。以BRC-ZQL3总DNA为模板,设计引物对该菌株的cry2基因进行PCR扩增。将PCR产物与克隆载体连接,得到重组质粒,转化JM109感受态细胞,测序可知目的基因ORF为1899 bp。将该基因序列提交NCBI（GenBank登录号: FJ550343.1）,国际Bt命名与分类委员会将其命名为cry2Ah2基因,其为一个新基因。用生物信息学软件分析该基因,其蛋白由632个氨基酸组成,分子量约为70.84 kDa;对该蛋白进行了同源比对和理化性质分析,同时预测了二维结构和三维结构。构建表达载体pGEX—cry2Ah2,转化大肠杆菌（E. coli） BL21（DE3）,得到具有重组质粒pGEX- cry2Ah2的BL21（DE3）,SDS-PAGE结果证明cry2Ah2基因能在该重组菌中成功表达。将重组大肠杆菌IPTG诱导培养,用其菌裂解液对A. cantonensis进行毒力测定,24 h和48 h的校正死亡率分别为12.77%和22. 91 %,证明Cry2Ah2蛋白对A. cantonensis具有一定程度的毒性,但其杀虫活性不高,这也表明BRC-ZQL3还存在其它的杀虫活性因子。为提高BRC-ZQL3产孢水平,应用数学统计方法对该菌株发酵培养基进行优化,获得最佳培养基配方为:黄豆饼粉2 %、玉米粉0.42 %、酵母膏0.39 %、磷酸二氢钾0.025 %、七水硫酸镁0.035 %、碳酸钙0.04 %、初始pH值为7.2。优化后BRC-ZQL3产孢水平达到3.92×108 mL-1,与响应面数学模型的预测值只有2.9%的误差,比初始发酵培养基产孢水平提高了60.66 %。本研究在国内外率先从地衣中分离获得了Bt菌株,不但增进了对Bt菌株习居环境的了解,而且也为野生型Bt新菌株的获得拓展了采集来源。同时,首次用Bt对A. cantonensis进行毒力测定,筛选到了对A. cantonensis具有较强杀虫活性的Bt菌株,并对该菌株的毒性因子进行研究,为寻找防治A. cantonensis的新途径作了有益探索。