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背景:视网膜疾病是一类严重影响人类视力及生活质量的疾病。视网膜的损伤尤其是视网膜上皮层的损伤,至今临床上尚无发现可靠有效的治疗方法。随着医学发展,采用药物、手术、激光等虽可控制病情,但无法从根本上治疗基因缺陷。而基因治疗越来越受到关注。随着对microRNAs家族研究的深入,microRNA24的基因功能引起研究热潮。目前国内就microRNA24对眼科疾病尤其是视网膜损伤的作用机制的研究尚不多见。 目的:将包装好的慢病毒载体分别用于细胞实验和动物实验,分别检测在体外和体内碘酸钠刺激的情况下,microRNA24的表达对碘酸钠造成的ARPE-19的损伤是否具有保护作用。 方法:(1)根据目的基因构建慢病毒载体,然后进行慢病毒包装、收获及浓缩,并且进行滴度的测定。(2)细胞实验:分别用0.3mg/ml,0.6mg/ml,1.2mg/ml,2.4mg/ml,4.8mg/ml,9.6mg/ml浓度的碘酸钠刺激视网膜上的不同细胞(ARPE-19,Muller,RGC-5),比较视网膜上各种细胞对碘酸钠的敏感性,为动物模型的建立提供依据。分别加入5μl,10μl,15μl的包装好的病毒,让其感染ARPE-19细胞,比较不同剂量感染后的ARPE-19细胞与单纯ARPE-19对碘酸钠刺激的敏感性是否有改变。(3)动物实验:取160g左右的SD大鼠20只,分为2组,裂隙灯及眼底镜检查排除角膜疾病,白内障及眼底疾病,ERG检查排除左右眼a波及b波振幅有差异者。第一组先按50mg/kg的剂量尾静脉注射碘酸钠溶液,2天后进行视网膜下腔病毒注射,统一规定右眼注射病毒5μl,左眼注射同等体积的灭菌的PBS溶液。第二组预先1周注射病毒,按照第一组的注射标准与方式,1周后再进行尾静脉注射碘酸钠溶液。两组分别于注射完成后1周,2周,4周,6周进行ERG检查,统计a波及b波振幅,看有无统计学差异。 结果:(1)成功构建了慢病毒载体,并且测试病毒滴度为2E+7TU/μl。(2)细胞实验:经不同浓度碘酸钠作用48h后,三种细胞(ARPE-19,Muller,RGC-5)IC50分别为(2.26±0.12)、(2.34±0.76)、(2.13±0.69)mg/ml。说明三种细胞对碘酸钠的敏感性依次为RGC-5>ARPE>Muller。对于每种细胞,随着碘酸钠浓度的升高,其存活率降低。分别收集24h,48h,72h病毒感染的ARPE-19细胞,不同剂量病毒感染后的细胞(ARPE-19+5μl,ARPE-19+10μl,ARPE+15μl)的IC50分别为(2.49±0.32)、(3.62±0.42)、(4.83±0.51)mg/ml。说明不同剂量病毒感染后 ARPE-19的50%碘酸钠抑制度浓度均较单纯ARPE-19细胞明显升高(P<0.05,?=0.05),而(ARPE+15μl)组相对单纯ARPE-19组升高更显著(P<0.05,?=0.05)。即在相同浓度的碘酸钠刺激下,(ARPE+15μl)组细胞存活率最高。这初步说明 microRNA24对 ARPE-19细胞是有保护作用的。而且这种保护作用在高剂量病毒组效果更显著。(3)动物实验:两组在1w,2w,4w周后做ERG检查,五个强度下左右两眼a波及b波均无振幅,对比无统计学差异(P>0.05)。在第6周做ERG检查,五个强度下两组均a波及b波均有振幅,但比较两组在五个强度下的a波及b波振幅并无统计学差异(P>0.05)。 结论:大鼠尾静脉注射碘酸钠可选择性破坏视网膜色素上皮细胞,成功建立视网膜损伤的动物模型;病毒感染的 ARPE-19细胞对碘酸钠刺激有抵抗作用,细胞存活率增高,说明microRNA24对碘酸钠造成的视网膜损伤有保护作用,并且与病毒剂量成正相关;视网膜下腔注射病毒后第六周 ERG检查 a波及 b波振幅同样验证了microRNA24对视网膜损伤的保护作用,但是否有预先保护作用在本实验中尚未验证。