目的：　　 分别建立稳定表达HLA-G1～-G4异构体的人绒癌细胞系，分析加载不同亲和力的抗原肽对HLA-G膜表达水平的变化，并观察HLA-G的表达对NK细胞杀伤活性的影响，深入研究HLA-G异构体的免疫调节作用。　　 方法：　　 1．HLA-G重组真核表达载体的构建采用PCR方法，以JEG-3细胞株mRNA逆转录产物cDNA为模板，扩增HLA-G1～-G4基因，并将其分别亚克隆入真核表达质粒pVITRO2-mcs，构建四种表达载体HLA-G1/pVITRO2-mcs，HLA-G2/pVITRO2-mcs,HLA-G3/pVITRO2-mcs和HLA-G4/pVITRO2-mcs;限制性内切酶双酶切和测序鉴定质粒构建是否正确。　　 2．人绒癌细胞株JAR-HLA-G1～-G4表达鉴定通过脂质体转染技术，分别建立稳定表达HLA-G1，-G2，-G3及HLA-G4抗原的人绒癌JAR细胞株，质粒pVITRO2-mcs作为阴性对照株，潮霉素筛选。在转录水平上，采用RT-PCR技术分析鉴定转染细胞中HLA-G1～-G4mRNA表达水平；在翻译水平上，采用流式细胞术、westernblot及免疫细胞化学法分析、鉴定转染细胞中HLA-G蛋白表达。　　 3．不同亲和能力抗原肽对HLA-G表达水平的分析通过加载HLA-G不同亲和能力抗原肽KIPAQFYIL（高）、KGPAQFYIL（中）、KGGAQFYIG（低），观察对HLA-G表达的影响。流式细胞术分析加载抗原肽前后HLA-G的表达水平的变化。　　 4．HLA-G异构体对NK细胞杀伤活性的影响采用LDH释放法检测HLA-G1，-G2，-G3及HLA-G4表达对NK细胞杀伤活性的影响。细胞毒活性测定参照CytoTox96(R)Non-RadioactiveCytotoxicityAssayKit(Promega)有关说明，通过下列公式计算杀伤率：杀伤率(％)=（实验孔-效应细胞自发释放-靶细胞自发释放）/(靶细胞最大释放-靶细胞自发释放)×100　　 结果：　　 1．HLA-G重组真核表达载体的构建和表达限制性内切酶双酶切及测序结果证实四种重组真核表达载体HLA-G1/pVITRO2-mcs，HLA-G2/pVITRO2-mcs，HLA-G3/pVITRO2-mcs和HLA-G4/pVITRO2-mcs构建成功。　　 2．人绒癌细胞株JAR-HLA-G1～-G4表达鉴定RT-PCR结果表明，HLA-G异构体转染细胞分别表达HLA-G1～-G4mRNA;westernblot及免疫细胞化学结果显示，HLA-G1～-G4/pVITRO2-mcs重组质粒成功转染HLA-G表达阴性的人绒癌JAR细胞株;FACS分析显示HLA-G1抗原能在JAR-HLA-G1细胞株表面表达，其他三种膜结合型抗原HLA-G2～-G4不能有效到达细胞表面。　　 3．不同亲和能力抗原肽对HLA-G表达水平的分析通过加载HLA-G不同亲和能力抗原肽，FACS分析显示HLA-G异构体在细胞膜上的表达水平无明显变化。　　 4．HLA-G异构体对NK细胞杀伤活性的影响体外杀伤实验发现表达HLA-G1～-G4抗原的细胞均能抑制NK细胞的杀伤活性（p＜0.05）；加载HLA-G高亲和性KIPAQFYIL抗原肽对HLA-G表达无明显影响，对NK细胞杀伤抑制程度也未见明显改变。　　 结论：　　 本研究成功构建真核表达载体HLA-G1～-G4/pVITRO2-mcs，并建立稳定表达膜结合型抗原HLA-G1～-G4的人绒癌细胞系，转染HLA-G抗原的细胞株能够明显抑制NK细胞的杀伤活性，提示不同膜结合型HLA-G异构体分子均能作为免疫耐受分子，具备免疫调节功能。