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背景目的:
急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是由肺内(外)因素引起的,以顽固性低氧血症为显著特征的临床综合征,因其高病死率而倍受关注。目前,国际上多采用“柏林定义”对ARDS做出诊断及其严重程度进行分层,并需与多种疾病进行鉴别诊断。除保护性机械通气治疗外,目前尚未找到经过证明的能降低其病死率以及能改善其预后的有效治疗策略。其病理生理变化主要是肺泡上皮结构的毁损性破坏,导致肺泡上皮屏障结果的破坏,进而引起肺水肿,肺功能障碍等。
肺泡上皮细胞在其中起重要作用,在ARDS过程在,ATⅡ可自身增殖,或者转分化为ATⅠ来维持肺泡结构和功能的完整性,以减少肺损伤。除了ATⅡ,成纤维细胞在ARDS过程中也发挥着至关重要的作用。成纤维细胞适当的增殖和活化可以促进炎症的发生,炎症因子的分泌,也可以修复损伤的结构;但如果成纤维细胞过度增殖,则会引起组织纤维化,疤痕形成,功能的丧失。因此,探讨ARDS过程中2种参与度比较高的细胞,任重而道远。
保护素DX(Protectin DX,PDX)是保护素(Protectin D1,PD1)/神经保护素D1(neuroProtectionD1,NPD1)的同分异构体,来源于天然的不饱和脂肪酸DHA,具有包括抑制中性粒细胞活化,减少炎症介质的产生,促进肺水清除,保护肺功能,抑制肺纤维化等的作用。是公认的抗炎促消退介质,有炎症反应的刹车信号的称号。
但目前尚未有研究证明PDX是否可以保护ARDS中肺泡II型上皮细胞以及成纤维细胞功能,以及其具体的机制。本实验以研究PDX对急性肺损伤中肺泡上皮细胞的自我修复和成纤维细胞功能为中心,探讨PDX保护急性肺损伤的具体机制。
研究方法:
1.采用体外LPS刺激小鼠肺原代成纤维细胞(6h,12h,24h,48h,72h)的不同时间点,而后给予保护素DX干预。用westernblot(WB)检测小鼠原代成纤维细胞的COX-2的表达,同时用酶联免疫法(ELISA)检测了细胞培养液上清中的前列腺素E2(PGE2)和前列腺素D2(PGD2)的水平。
2.TGF-?1(10ng/ml)刺激成纤维细胞24h,外加PDX100nM治疗,用BrdU细胞增殖试剂盒来检测的增殖情况;采用细胞浓度试剂盒来检测细胞的存活度;采用实时荧光定量PCR测定相关基因(CDH-2,α-SMA,Vimentin,collagenI,collagenIII)的表达。
3.采用细胞培养板中的划痕面积实验来测定保护素DX对肺泡II型上皮细胞损伤修复的影响;采用BrdU细胞增殖试剂盒测定相关细胞的增殖;采用细胞浓度试剂盒来测定细胞的存活度;采用实时荧光定量多聚酶链反应(Q-PCR)来测定相关基因的表达;采用免疫荧光来检测在体的增殖(SP-C&PCNA共染)与凋亡(SP-C & TUNEL)情况;流式细胞术检测体外肺泡二型上皮细胞的凋亡情况;采用实时荧光定量PCR技术来检测相关转分化基因的表达。
实验结果:
1.本实验结果表明,小鼠肺成纤维细胞在LPS诱导后其COX-2的表达分别在6h和24h出现了高峰,且24h的峰值高于6h的峰值。并且对应时间点的ELISA结果显示,PGE2在6h也达到峰值;而PGD2在6h和24h分别达到峰值,并且24h峰值高于6h峰值。外源性的给予PDX后可以抑制小鼠肺成纤维细胞COX-2的6h峰,促进其24h峰;并且可以剂量依赖性的抑制PGE26h的表达,促进PGD224h峰的表达,而对6h峰无影响。
2.本实验证实了保护素DX能抑制TGF-?1诱导的小鼠原代肺成纤维细胞增殖以及胶原蛋白的合成和向肌纤维母细胞转化标记的基因表达,并且保护素DX的这种保护作用是通过激活PI3-K通路及FPR受体的方式剂量依赖性的实现的。
3.本实验结果表明保护素DX能够促进原代小鼠肺泡II型上皮细胞的损伤后修复,促进肺泡II型上皮细胞的增殖;同时,PDX还可以抑制LPS诱导的小鼠的原代肺泡II型上皮细胞的凋亡,促进肺泡II型上皮细胞分化为I型上皮细胞,并且这些作用也是通过PI3K/AKT和FPR受体起作用的。
结论:
本研究结果表明,保护素DX可以双向调节成纤维细胞COX-2的表达(即抑制6h时间点的表达,促进24h时间点的表达),抑制6h炎症介质PGE2的表达,促进24h时间点消退期促消退介质PGD2的表达。从而使炎症从急性的开始转为消退期。进一步研究成纤维细胞的功能发现,PDX可以剂量依赖性的抑制成纤维细胞的增殖,抑制其胶原合成,并抑制其向肌纤维母细胞分化。更进一步研究肺泡结构的完整性发现:PDX可以显著促进肺泡二型上皮细胞的增殖,抑制其凋亡,体内外实验皆成立。并促进其转分化为肺泡一型上皮细胞,为肺泡结构和功能的完整性提供了依据。有本实验结论可知:PDX可能部分通过依赖调节COX-2及其产物的方式来促进急性呼吸窘迫综合征中肺部炎症的消退,抑制增殖期成纤维细胞的过度增殖,胶原沉积和活化为肌纤维母细胞,从而抑制ARDS走向慢性纤维化;从上皮层面,PDX能够保护上皮从多个层面保持其结构和功能的完整性。总之:本实验结果为保护素DX促进炎症消退提供了全新的证据,提示了保护素DX可以通过抑制ARDS早期炎症和增殖期(早期纤维化阶段)来促进ARDS的炎症消退。故本实验为临床应用保护素DX防治急性呼吸窘迫综合征及多器官功能不全综合征提供新的思路和依据。
急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是由肺内(外)因素引起的,以顽固性低氧血症为显著特征的临床综合征,因其高病死率而倍受关注。目前,国际上多采用“柏林定义”对ARDS做出诊断及其严重程度进行分层,并需与多种疾病进行鉴别诊断。除保护性机械通气治疗外,目前尚未找到经过证明的能降低其病死率以及能改善其预后的有效治疗策略。其病理生理变化主要是肺泡上皮结构的毁损性破坏,导致肺泡上皮屏障结果的破坏,进而引起肺水肿,肺功能障碍等。
肺泡上皮细胞在其中起重要作用,在ARDS过程在,ATⅡ可自身增殖,或者转分化为ATⅠ来维持肺泡结构和功能的完整性,以减少肺损伤。除了ATⅡ,成纤维细胞在ARDS过程中也发挥着至关重要的作用。成纤维细胞适当的增殖和活化可以促进炎症的发生,炎症因子的分泌,也可以修复损伤的结构;但如果成纤维细胞过度增殖,则会引起组织纤维化,疤痕形成,功能的丧失。因此,探讨ARDS过程中2种参与度比较高的细胞,任重而道远。
保护素DX(Protectin DX,PDX)是保护素(Protectin D1,PD1)/神经保护素D1(neuroProtectionD1,NPD1)的同分异构体,来源于天然的不饱和脂肪酸DHA,具有包括抑制中性粒细胞活化,减少炎症介质的产生,促进肺水清除,保护肺功能,抑制肺纤维化等的作用。是公认的抗炎促消退介质,有炎症反应的刹车信号的称号。
但目前尚未有研究证明PDX是否可以保护ARDS中肺泡II型上皮细胞以及成纤维细胞功能,以及其具体的机制。本实验以研究PDX对急性肺损伤中肺泡上皮细胞的自我修复和成纤维细胞功能为中心,探讨PDX保护急性肺损伤的具体机制。
研究方法:
1.采用体外LPS刺激小鼠肺原代成纤维细胞(6h,12h,24h,48h,72h)的不同时间点,而后给予保护素DX干预。用westernblot(WB)检测小鼠原代成纤维细胞的COX-2的表达,同时用酶联免疫法(ELISA)检测了细胞培养液上清中的前列腺素E2(PGE2)和前列腺素D2(PGD2)的水平。
2.TGF-?1(10ng/ml)刺激成纤维细胞24h,外加PDX100nM治疗,用BrdU细胞增殖试剂盒来检测的增殖情况;采用细胞浓度试剂盒来检测细胞的存活度;采用实时荧光定量PCR测定相关基因(CDH-2,α-SMA,Vimentin,collagenI,collagenIII)的表达。
3.采用细胞培养板中的划痕面积实验来测定保护素DX对肺泡II型上皮细胞损伤修复的影响;采用BrdU细胞增殖试剂盒测定相关细胞的增殖;采用细胞浓度试剂盒来测定细胞的存活度;采用实时荧光定量多聚酶链反应(Q-PCR)来测定相关基因的表达;采用免疫荧光来检测在体的增殖(SP-C&PCNA共染)与凋亡(SP-C & TUNEL)情况;流式细胞术检测体外肺泡二型上皮细胞的凋亡情况;采用实时荧光定量PCR技术来检测相关转分化基因的表达。
实验结果:
1.本实验结果表明,小鼠肺成纤维细胞在LPS诱导后其COX-2的表达分别在6h和24h出现了高峰,且24h的峰值高于6h的峰值。并且对应时间点的ELISA结果显示,PGE2在6h也达到峰值;而PGD2在6h和24h分别达到峰值,并且24h峰值高于6h峰值。外源性的给予PDX后可以抑制小鼠肺成纤维细胞COX-2的6h峰,促进其24h峰;并且可以剂量依赖性的抑制PGE26h的表达,促进PGD224h峰的表达,而对6h峰无影响。
2.本实验证实了保护素DX能抑制TGF-?1诱导的小鼠原代肺成纤维细胞增殖以及胶原蛋白的合成和向肌纤维母细胞转化标记的基因表达,并且保护素DX的这种保护作用是通过激活PI3-K通路及FPR受体的方式剂量依赖性的实现的。
3.本实验结果表明保护素DX能够促进原代小鼠肺泡II型上皮细胞的损伤后修复,促进肺泡II型上皮细胞的增殖;同时,PDX还可以抑制LPS诱导的小鼠的原代肺泡II型上皮细胞的凋亡,促进肺泡II型上皮细胞分化为I型上皮细胞,并且这些作用也是通过PI3K/AKT和FPR受体起作用的。
结论:
本研究结果表明,保护素DX可以双向调节成纤维细胞COX-2的表达(即抑制6h时间点的表达,促进24h时间点的表达),抑制6h炎症介质PGE2的表达,促进24h时间点消退期促消退介质PGD2的表达。从而使炎症从急性的开始转为消退期。进一步研究成纤维细胞的功能发现,PDX可以剂量依赖性的抑制成纤维细胞的增殖,抑制其胶原合成,并抑制其向肌纤维母细胞分化。更进一步研究肺泡结构的完整性发现:PDX可以显著促进肺泡二型上皮细胞的增殖,抑制其凋亡,体内外实验皆成立。并促进其转分化为肺泡一型上皮细胞,为肺泡结构和功能的完整性提供了依据。有本实验结论可知:PDX可能部分通过依赖调节COX-2及其产物的方式来促进急性呼吸窘迫综合征中肺部炎症的消退,抑制增殖期成纤维细胞的过度增殖,胶原沉积和活化为肌纤维母细胞,从而抑制ARDS走向慢性纤维化;从上皮层面,PDX能够保护上皮从多个层面保持其结构和功能的完整性。总之:本实验结果为保护素DX促进炎症消退提供了全新的证据,提示了保护素DX可以通过抑制ARDS早期炎症和增殖期(早期纤维化阶段)来促进ARDS的炎症消退。故本实验为临床应用保护素DX防治急性呼吸窘迫综合征及多器官功能不全综合征提供新的思路和依据。