帕金森病(PD)是一种中老年人常见的中枢神经系统变性疾病,发病率呈逐年上升趋势。目前PD的病因尚不明确,但与多种因素有关,如氧化应激、线粒体功能异常、兴奋毒作用、细胞凋亡及遗传因素等,上述多种因素造成了大脑黑质-纹状体多巴胺神经元变性而引发临床症状。目前临床上PD的治疗多采用化学药物疗法,因疗效不理想和副作用较大,寻找新的治疗手段和途径已成为迫切需要。20世纪90年代初,神经干细胞(NSCs)的发现是神经科学界的突破性进展,尤其成体NSCs的存在揭开了人类神经科学研究的新篇章。在衰老及其相关的神经退行性疾病患者的脑内,不仅有神经元的变性丢失,而且有神经发生的异常,提示神经发生障碍可能参与了神经退行性病变过程。因此近年NSCs移植治疗和外源因素调节内源性神经发生的研究成为神经科学的热点之一。用于移植的细胞有胚胎NSCs、胚胎干细胞、骨髓干细胞等,但移植细胞的来源大多有限,且有成瘤性、伦理学等方面的缺点,限制了其临床应用。而人羊膜细胞(HACs)是来源于正常产妇产后的废弃组织,抗原性低,无伦理学问题,尤其近年来研究表明,羊膜组织细胞具有神经生物学特点和功能,如存在着神经前体细胞等,这些优势使羊膜组织细胞有望成为再生医学领域的可靠细胞来源。我们通过形态学和分子生物学手段,观察羊膜细胞的神经生物学特性。尽管现有研究已证明移植细胞可以在宿主体内生存,但移植的细胞大约90%将会死亡或凋亡,其原因主要是氧化应激引起的微环境不适。褪黑素(MT)是松果体分泌的一种吲哚类神经内分泌激素,有很强的清除自由基和间接抗氧化作用。同时,MT易于通过血脑屏障和细胞膜等生物膜,具有很强的中枢神经系统的亲和性;加之MT作为一种内源性的神经内分泌激素,有良好的吸收率,并可通过多种途径给药,无明显不良反应,因此在中枢神经系统疾病中有一定的应用前景。作为一种内源性因子,MT在其他细胞的保护作用已经得到证实,但它对脑内的NSCs和神经发生是否产生影响未见报道。本研究设计了体内、外试验,观察MT对NSCs增殖和分化的影响,同时观察MT及其联合羊膜细胞移植对MPTP致PD小鼠的疗效,试图探讨其可能的作用机制。第一部分MT对大鼠胚胎中脑NSCs增殖和分化的影响1.从大鼠胚胎中脑分离培养NSCs,免疫荧光实验证实,NSCs及其增殖形成的神经球都表达标志性抗原巢素(Nestin)。PCR-ELISA方法表明培养的NSCs呈现高水平的端粒酶活性。说明我们培养的细胞是NSCs。2.通过相差显微镜观察,我们发现与对照组相比,MT不仅显著提高总神经细胞球的数量,还可以提高大细胞球的比率;采用MTS的方法观察到MT(0.05、0.1和1 nM)可以剂量依赖性地增加NSCs的OD值。说明MT有促进NSCs增殖的作用。3.采用MTS的方法观察到MPP~+(1、10、50和100μM)明显降低NSCs的细胞活性;当加入MT(0.1和1 nM)与细胞作用1h后,OD值与Mpp~+(50μM)组相比明显升高,说明MT能有效对抗Mpp~+对NSCs的毒性作用。4.NSCs在含MT(1nM)的分化培养基中生长6d后,采用细胞免疫荧光、RT-PCR和western blot方法,均观察到分化细胞中TH的表达明显增加,GFAP显著降低。说明MT在促进NSCs向多巴胺能神经元分化的同时抑制其向星形胶质细胞的分化。5.通过RT-PCR方法,检测到NSCs可以表达MT的两个受体的亚型—MT1和MT2。同时观察到MT(1nM)可明显促进BDNF和GDNF的表达,这可能与MT调节NSCs增殖和分化有关。第二部分羊膜组织细胞的神经生物学特性1.通过免疫组织化学染色方法,证明羊膜组织细胞中存在MAP2、NeuN、β-Tubullin-Ⅲ、TH、CNPase和GFAP等阳性细胞。说明羊膜组织细胞具有神经生物学特性。2.羊膜组织细胞中还存在Nestin、Musashi-1、Vimentin和PSA-NCAM阳性细胞,同时发现以上阳性细胞部分呈现与BrdU免疫荧光双标阳性;而且检测到培养的HACs可以表达Nestin mRNA。这些结果提示羊膜组织细胞可表达神经干细胞的特异性蛋白,并且具有增殖活性。3.培养的HACs中存在BrdU与Tubulin、TH、CNPase和GFAP双标染色阳性细胞,RT-PCR方法可见GFAP mRNA的表达。说明这些增殖的羊膜细胞可以分化为神经元、多巴胺能神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞,进一步表明其多分化潜能。第三部分羊膜细胞移植合并褪黑素治疗MPTP致PD小鼠模型的实验研究1.以MPTP(15mg/kg,i.p.,x4次)处理雄性C57BL/6小鼠,成功制备了PD小鼠模型。与对照组相比,行为学检测表现为转杆次数(16 rpm和20 rpm)明显减少,自发运动次数亦明显减少,Morris水迷宫实验寻台潜伏期和游泳路程明显延长。2.组织形态学表明,PD模型鼠脑纹状体和黑质区神经元有明显损伤,表现为尼氏小体蓝色颗粒减少、细胞核浓缩和胞浆空泡样变性。TH免疫组织化学和免疫荧光化学染色显示多巴胺神经元数目明显减少。3.经HACs移植、MT及二者联合治疗2-4w后,可使MPTP-PD小鼠的上述行为学和形态学的改变均得到不同程度的改善。4.HACs及与MT联合移植组小鼠纹状体区内可见HNA和HMA阳性标记的细胞,并可见PKH26/TH双标阳性细胞的存在,说明移植成活的HACs部分已分化为多巴胺能神经元。5.HACs移植、MT和二者联合治疗可以提高纹状体区神经营养因子BDNF和GDNF的表达,并明显促进SVZ区BrdU阳性细胞的增加。6.本研究提示,HACs移植以及与MT联合应用,可能是通过增加神经营养因子的表达和促进SVZ区的细胞增殖,发挥治疗PD的协同作用。综上所述,本研究通过体外实验表明MT可以促进NSCs的增殖,并对MPP~+损伤模型发挥保护作用;同时促进NSCs向多巴胺能神经元分化,而降低向星形胶质细胞的分化。这可能与MT促进NSCs表达神经营养因子BDNF和GDNF有关。HACs具有神经生物学特性,其单独移植以及与MT二者联合应用均可不同程度改善MPTP-PD模型小鼠运动协调能力、自发运动和学习记忆损伤等症状。这与移植的HACs能够在脑内存活并进行有效的靶向分化、提高脑区神经营养因子的表达和促进SVZ细胞增殖有关。本研究提供了有关HACs和MT两者新的神经生物学特性的实验数据,尝试并摸索了两者对神经退行性病PD模型进行治疗的规律,这为今后拓宽临床治疗思路并开展相关研究奠定了基础。