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[背景] 胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，化疗是其重要疗法，而胃癌的多药耐药性(MDR)却往往导致化疗的最终失败。因此，深入研究胃癌细胞耐药性的分子机制已成为提高疗效和预后的关键问题。国内外已经发现的众多耐药相关分子(诸如P-gp、MRP、LRP、BCRP、GST、PKC、TopoⅡ等)尚不能完全解释胃癌的MDR，提示胃癌细胞中可能存在着未知的耐药分子和耐药机制。 人假想镁离子转运基因(human putative magnesiumtransporter,HPT)是2000年发现的一个位于6号染色体(6p22.1-p22.3)，由11个外显子组成的新基因。其编码的蛋白(HPT protein)定位于线粒体内膜，迄今为止对其功能了解很少。本研究所利用抑制消减杂交技术(SSH)研究胃癌敏感细胞SGC7901及其耐药亚系SGC7901／ADR的差异表达基因，结果发现HPT基因在SGC7901／ADR细胞中的表达高于SGC7901细胞，提示HPT可能是一个新的胃癌耐药相关分子。因此进一步研究HPT与胃癌MDR的相关性可能有助于我们对HPT功能及胃癌MDR分子机制的深入了解。第四军医大学硕士学位论文 本课题拟制备HPT蛋白的抗体检测sGc7901及SGC79OI/ADR细胞中HPT蛋白的表达差异;并采用正反义核酸技术进一步研究HPT在胃癌细胞MDR形成中的作用，初步探讨其可能的作用机制，以期为逆转胃癌细胞MDR的研究奠定基础。t目的】(l)构建HPT原核表达载体诱导表达HPT蛋白，免疫小鼠制备抗血清并检测其在胃癌耐药细胞中的表达;②构建HPT正、反义核酸真核表达载体，分别转染SGC7901和SGC7901/ADR细胞，研究HPT与胃癌细胞MDR的相关性及其可能的机制。t方法l(l)在克隆成功HPT基因cDNA的基础上，采用DNA重组技术构建其原核表达载体pRsETB/HPT，酶切鉴定;(2)经IPTG诱导在大肠杆菌BLZI体内表达HPT与6 x His的融合蛋白，并以SDS一PAGE和westem blot鉴定;(3)用含融合蛋白的聚丙烯酞胺凝胶颗粒免疫BALB/。小鼠制备抗血清，用Westem blot进行鉴定:(4)以所制备的抗血清检测HPT蛋白在胃癌耐药细胞系SGC7901/A DR及其敏感亲本细胞系SGC7901中的表达;⑤采用分子克隆技术，将HPT基因全长cDNA片段分别按正、反方向克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)的多克隆位点之间，构建HPT正、反义核酸，酶切鉴定;(6)用脂质体介导法分别转染HPT正、反义核酸入胃癌药敏细胞SGc7901及耐药细胞sGC7901/ADR，经G418筛选，W七stem blot法鉴定获得稳定转染克隆;(7) Ml，T法对转染细胞及对照细胞进行体外药物敏感性分析，计算细胞对ADR的Ics。值;(8) MTT法绘制转染细胞及对照细胞的生长曲线;(9)以流式细胞仪(FCM)检测转染细胞及对照细胞内ADR的蓄积、储留浓度，计算细胞的药物泵出率;帅流式细胞仪 (FCM)检测转染细胞及对照细胞的细胞周期，计算细胞的增殖第四军医大学硕士学位论文指数;ao以流式细胞仪(FCM)检测ADR作用下转染细胞及对照细胞的凋亡，计算细胞的凋亡指数。t结果l(l)成功构建了HpT基因的原核表达载体pRsETB/HpT，并经酶切鉴定证实:(2) SDS一PAGE检测显示，经IPTG诱导后，BL21/P RsETB一HPT总蛋白中出现一条约55KDa的新生蛋白带，W七stem blot进一步证实该新生蛋白为与6 x His融合的蛋白;(3)该融合蛋白免疫小鼠血清经W七stern blot检测仅识别SGC7901细胞中一条大小约为SOKDa的蛋白带;其血清即使被稀释1000倍，仍然显示与靶蛋白有较强的结合活性:(4)检测发现sGC79o一/^nR中HPT蛋白表达水平高于SGC7901;(5)成功构建了HPT编码基因的正、反义真核表达载体，酶切鉴定正确;(6)获得了稳定转染正义载体的细胞克隆7901/z cen，其HPT蛋白表达水平显著高于空载体pcDNA3.1(+)转染之细胞克隆7901服cel卜获得了稳定转染反义载体的细胞克隆ADP了F CELL，其HPT蛋白表达水平显著高于空载体pcDNA3.1(+)转染之细胞克隆AD刃KCELL;(7)体外药物敏感试验结果显示7901/2 ceU细胞对ADR的药物耐受性明显高于7901瓜ceU细胞，生存率显著增高:AD侧FCELL细胞对ADR的药物耐受性低于AD侧K CELL细胞，生存率有所降低;(8)生长曲线显示790112 cen细胞增殖能力高于7901服cen细胞，AD侧F CELL细胞增殖能力低于AD侧KCELL细胞;(9) FcM检测结果示7901/z。ell细胞内ADR的蓄积、储留量明显低于7901/K cen细胞，药物泵出率明显升高;AD侧F CELL细胞内ADR的蓄积、漪留量明显高于AD侧K CELL细胞，药物泵出率明显降低;帅FCM检测细胞周期示与7901/K cen相比，7901/zcen细胞Gl期减少，GZ期及S期增高，细胞增殖能力增强;与ADR/K CELL相比，AD侧F CELL细胞Gl期增多，GZ期及S期降低，细胞增殖能力减弱;QD与7901/K eell细胞相比，7901/2 eell第四军医大学硕士学位论文细胞的凋亡明显降低;与AD侧K CELL细胞相比，AD侧F CELL细胞的凋亡明显增多。[结论1(1)成功地原核表达了HPT蛋白并制备了抗血清，检测发现耐药细胞SGC7901/ADR中HPT蛋白的表达高于药敏的SGC7901细胞;(2)通过基因转染发现胃癌细胞中HPT蛋白表达水平的变化可导致胃癌细胞耐药性的变化，说明HPT参与了胃癌细胞MDR的形成;(3) HPT参与胃癌细胞MDR的机制可能与其导致细胞内药物浓度降低、细胞凋?