第一部分Cofilin-1在高血压肾损伤中的作用机制研究研究背景肾脏是高血压靶器官损伤的重要一部分,约1/5的高血压患者最终出现肾功能异常。高血压肾病的发病机制十分复杂,肾素-血管紧张素系统激活、盐负荷增加、血管活性物质失衡、遗传等因素都参与了高血压的肾脏损伤。炎症与上述因素互为因果,参与高血压肾病的发生发展。核因子-κB (nuclear factor-κB, NF-κB)是一种广泛存在的核转录因子,在肾脏疾病的发病过程中被激活,从而参与调控炎症介质的产生。静息状态下,无活性的NF-κB存在于胞浆中,各种刺激导致NF-κB发生核转位,与靶基因位点结合,最终导致下游炎症因子的表达升高。NF-κB核转位过程需要借助肌动蛋白骨架结构的动力学改变,因此研究细胞骨架,尤其是肌动蛋白微丝系统,是深入认识高血压肾脏炎症损伤机制的重要切入点。丝切蛋白1(Cofilinl)是一种重要的肌动蛋白结合蛋白,它通过切割和解聚肌动蛋白微丝调节肌动蛋白微丝动力学及其重组,参与多种生理过程。研究发现,Cofilinl参与内皮细胞NF-κB的核转位过程,但是它在肾小管上皮细胞、高血压肾病模型中的作用仍然未知。因此,本课题将利用自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats, SHRs)模型及血管紧张素Ⅱ (angiotensin Ⅱ, AngⅡ)刺激的肾小管上皮细胞,借助各种组织病理学染色技术和分子生物学手段,研究cofilin-1在高血压肾病发生发展中的作用机制。这些结果将为高血压肾损伤患者的早期防治提供新靶点,具有重要的理论意义和潜在的临床应用价值。研究目的1.研究自发性高血压大鼠的NF-κB活性及炎症因子的表达情况,cofilinl的表达改变情况；2.了解血管紧张素Ⅱ处理的肾小管上皮细胞炎性表达情况及cofilinl的改变；3.探索cofilinl参与高血压肾脏炎症过程的分子机制。研究方法动物实验：21周龄自发性高血压大鼠20只及同周龄的wistar-kyoto大鼠(WKYs)10只,随机分为3组(每组10只)：SHR-C组(SHR对照组),SHR-H组(SHR治疗组),WKY-C(WKY对照组)。SHR-H组,即葡萄籽原花青素(grape seed proanthocyanidin extract,GSPE)治疗对照组。SHR-C组及WKY-C组每天给予1ml生理盐水灌胃,SHR-H组每天给予250mg/kg GSPE灌胃,持续灌胃22周。实验期间监测尾动脉血压、体重,收集24小时尿并记录尿总量,取少量离心后留取上清以备后用。实验结束时麻醉动物,留取标本。细胞实验：体外培养人肾小管上皮细胞系(HK-2),用Ang Ⅱ处理12小时,观察monocyte chemotactic proteinl(MCP1)、Interleukin-1β(IL-1β)表达及NF-κB核转位的情况；GSPE预处理后重复上述实验,用于初步了解AngⅡ的促炎效果及GSPE的治疗效果。构建干扰cofilinl表达的载有cofilinl-shRNA的慢病毒(Lv-cfl-shRNA),摸索转染条件,验证干扰效率,然后正式转染,获得cofilinl干扰的细胞,传代后用于后续实验。用血管紧张素Ⅱ刺激转染了Lv-cfl-shRNA或转染了空白病毒Lv-con-shRNA的HK-2细胞,观察应力纤维形成、MCP1、IL-1β表达及NF-κ B核转位情况。1.留取腹主动脉血及24小时尿,离心后取上清,用于后续血肌酐、尿素氮、24小时尿蛋白总量等体液学指标；2.病理学检测：对大鼠肾脏组织进行HE染色,观察各组大鼠肾组织病理改变；3.免疫组织化学染色：应用免疫组织化学染色观察MCP1、IL-1β、NF-κB的表达情况；4.酶联免疫吸附实验：应用MCP1、IL-1β酶联免疫吸附试剂盒检测大鼠肾组织匀浆中的含量；5.细胞免疫荧光染色：应用免疫荧光染色来观察不同处理组细胞NF-κB分布情况,进而比较NF-κB的活性差异；6.细胞骨架染色：应用鬼笔环肽染色法观察不同处理对细胞应力纤维形成的影响。7.NF-κ B的双荧光素酶报告基因检测：pNF K B-TA-luc报告基因质粒转染正常HK-2细胞、cofilinl干扰的HK-2细胞,然后血管紧张素Ⅱ刺激,检测萤光素酶活性情况,从而探讨不同细胞组间的NF-κB活性。8.Western blot检测：取大鼠肾脏皮质,提取组织总蛋白,Western blot检测cofilin-1、p-cofilin1、Iκ-Ba的蛋白表达量。干预结束时收集不同细胞组的细胞并抽提细胞总蛋白或者胞核、胞浆蛋白用于检测cofilin-1、 p-cofilin1、NF-κ、Iκ-Bα、MCP1、IL-10等的表达水平。研究结果1.各组大鼠体重、血压变化：至实验结束时,各组间大鼠的体重无统计学差异(P>0.05)。整个实验过程中(21周龄-43周龄)SHR大鼠的血压随着周龄的增长而升高,且显著高于同周龄WKY大鼠的血压；实验末,与SHR-C组相比,SHR-H组血压略下降,但差异无统计学意义(P>0.05)。提示本实验中GSPE处理对大鼠的血压无明显影响。2.血清肌酐、尿素氮测定：三组间比较,血清肌酐、尿素氮均没有统计学差异(P>0.05)。3.24小时尿蛋白总量：与WKY-C组相比,各SHR组大鼠的尿蛋白总量明显增高(P<0.01)；与SHR-C组相比,SHR-H组尿蛋白则明显降低(P<0.01)4.肾脏病理学改变：HE染色显示,与WKY-C组大鼠相比,SHR-C组大鼠肾小管上皮细胞水肿较明显,炎性细胞浸润明显增多；经过GSPE治疗无论是炎性浸润还是肾小管水肿都明显好转。定量计数切片中的炎性相关细胞(中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞)发现,与WKY-C组大鼠相比,SHR-C组炎症细胞明显增多(P<0.01)；与SHR-C组相比,SHR-H组炎症细胞浸润明显减少(P<0.01)。5. 肾炎症因子及NF-κB表达：ELISA结果表明,与WKY-C组相比,SHR-C组大鼠肾组织中MCP1及IL-1β升高(P<0.01)；而SHR-H组与WKY-C相则水平相仿,提示高剂量GSPE抗炎效果显著。MCP1、IL-1β的免疫组化染色显示它们在肾小管、肾小球均表达,主要位于细胞浆内。与WKY-C组相比,IL-1 β水平在SHR-C、SHR-H组表达均明显升高(P<0.01)；与SHR-C相比,SHR-H组明显降低(P<0.01)。MCP-1在各组间的表达趋势与IL-1β呈现相似趋势。NF-κB染色显示,在WKY-C组大鼠肾脏中,NF-κB少量表达,主要分布在肾小管细胞胞浆内；与WKY-C组相比,SHR-C组、SHR-H组表达增多,主要在细胞核表达,差异具有统计学意义(P<0.05)。与SHR-C组相比,SHR-H表达降低(P<0.01)。6.肾脏cofilinl活性改变及Iκ-Bα表达：Western blot检测大鼠肾脏组织中的cofilinl表达情况显示,各组间cofilinl,总量表达无统计学差异(P>0.05),与WKY-C组相比,SHR-C组p-cofilinl的表达水平明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01),经过GSPE治疗后,SHR-H组的p-cofilinl有所降低(P<0.05)。相比于WKY-C组大鼠I κ-Bα水平,SHR-C组明显降低(P<0.01),SHR-H组则无显著差异(P>0.05),提示GSPE治疗可以抑制I κ-Bα的降解。7.肾小管上皮细胞cofilin1、炎症因子表达改变情况：Western blot结果显示,与空白对照组细胞(control组)相比,AngⅡ刺激后,cofilinl总水平无明显差异,p-cofilin1、IL-1β、MCP1表达水平升高(P<0.05),GSPE治疗后以上各蛋白表达较AngⅡ刺激组均降低(P<0.05)。8.肾小管上皮细胞cofilinl敲除对AngⅡ诱导的应力纤维形成的影响：罗丹明标记的鬼笔环肽染色显示Ang Ⅱ刺激增加应力纤维形成。细胞转染了携带cofili n干扰序列的慢病毒Lv-cfl-shRNA及空白慢病毒Lv-con-shRNA,转染及干扰效率均高于90%。Lv-cfl-shRNA转染后导致应力纤维过度形成,而转染空白病毒组则对应力纤维形成并无影响。Western blot显示,cofilinl1干扰或AngⅡ刺激都可以促使F-actin表达增高,而cofilin干扰+Ang Ⅱ刺激导致的F-actin表达最高,差异具有统计学意义(P<0.05)。9.Cofilinl敲除对AngⅡ诱导的HK-2细胞NF-κB p65核转位的影响：Westernbl ot检测细胞核、胞浆的p65表达情况发现,正常HK-2细胞的p65主要在胞浆中表达,经过AngⅡ刺激后胞核内p65表达明显增多,胞浆内则明显减少,这种差异具有统计学意义(P<0.05)。Cofilinl干扰表达或者GSPE预处理后,Ang Ⅱ刺激所导致的细胞核内p65增多效应不同程度的被抑制,差异具有统计学意义(P<0.05)。利用荧光素酶报告基因检测对不同处理组细胞进行NF-κB活性测量,测量结果发现,与正常对照组相比,其余各组的NF-κB活性都明显升高(P<0.01)；与cofilinl干扰+Ang Ⅱ刺激组相比,单纯Ang Ⅱ刺激组、空白病毒+Ang Ⅱ刺激组NF-κB活性均较高(P<0.05),但与GSPE预处理组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。细胞免疫荧光染色结果与上述结果基本一致。10. Cofil in1敲除对AngⅡ刺激HK-2的炎症因子表达情况：AngⅡ刺激12小时候导致HK-2细胞MCP1、IL-1β表达明显增加(P<0.01), cofilinl干扰抑制它们的表达(P<0.05), cofilinl干扰与GSPE预处理组相比,炎症因子抑制作用无统计学差异(P>0.05)。结论1.SHR大鼠肾脏炎性因子高表达同时伴有cofilinl活性降低。2.Ang Ⅱ可以刺激肾小管上皮细胞炎性因子表达升高伴cofilinl活性降低。3. Cofilinl通过改变细胞骨架结构调节肾小管上皮细胞NF-K B核转位,进而参与高血压肾损伤。第二部分葡萄籽原花青素对高血压肾损伤的保护效应研究研究背景在高血压动物模型中,氧化应激是肾脏出现最早的病理变化,贯穿在整个肾损伤的过程中。高血压时,血管紧张素Ⅱ水平升高,刺激肾小球系膜细胞、肾小管细胞上的NADPH氧化酶产生活性氧簇增多,从而激活细胞内信号转导系统,并可活化细胞转录因子如核因子-κB(NF-κB),继而导致了炎性因子表达增多,同时导致细胞外基质合成增多、降解减少,最终肾小管间质发生纤维化。活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)可以通过血管紧张素Ⅱ提高肾小球毛细血管跨膜压,并且可以攻击体内的不饱和脂肪酸,产生脂质过氧化物产物丙二醛及短链羟基使得血管通透性增加,增加蛋白尿。由于氧化应激在高血压肾损伤发病中的作用越来越明确,有关抗氧化剂替代治疗的研究也进一步引起了我们的重视。原花青素是一类广泛存在于植物中的多酚类化合物。葡萄籽原花青素(GSPE)是从葡萄籽中萃取分离得到的一种新型高效抗氧化剂,原花青素含量高达95%,其抗氧化能力是维生素E的50倍,维生素C的20倍。目前研究发现,葡萄多酚能够降低自发性高血压大鼠的血压、增加血管的顺应性并减轻心脏肥厚。此外,我课题组之前研究发现GSPE有着显著改善糖尿病大鼠肾损伤的作用。鉴于大量研究结果中GSPE的抗氧化、抗炎效应,第一部分研究中我们已经将GSPE用作抗炎药物治疗高血压大鼠及血管紧张素Ⅱ处理的肾小管上皮细胞,其肾脏保护效果是显著的。为了全面评估GSPE在高血压肾损伤中的保护机制,我们又进行了本部分实验。研究目的1.观察SHR大鼠肾脏组织学病变的特点,研究GSPE对这些病变的治疗效果；2.检测SHR大鼠肾脏炎症和纤维化的水平,评估GSPE在高血压肾损伤中抗炎、抗纤维化的效应；3.检测SHR大鼠肾脏氧化应激水平,评估GSPE在高血压肾损伤中的抗氧化能力。研究方法与上部分研究中的动物实验相同,但是新增SHR-L组,即SHR低剂量治疗组,即每天给予100mg/kg GSPE灌胃,持续灌胃22周。实验期间每隔2周于周末收集24小时尿并记录尿总量,取少量离心后留取上清以备后用。实验结束时候麻醉动物,留取标本。1.实验开始前及实验过程中每周测量大鼠体重、大鼠尾动脉收缩压。2.留取腹主动脉血及24小时尿,离心后取上清,用于后续血肌酐、尿素氮、尿肌酐、24小时尿蛋白、尿微量白蛋白等体液学指标检测；3.对大鼠肾脏组织分别进行HE、PAS、Masson染色及透射电镜观察,观察各组大鼠肾组织病理改变；4.应用酶联免疫吸附试剂盒检测大鼠肾组织匀浆中IL6、TNF-α的蛋白含量；5.应用RT-PCR技术检测肾组织中IL6、TNF-α的mRNA含量；6.应用Western blot检测肾组织NF-κB p65磷酸化蛋白表达情况；7.应用免疫组织化学染色观察TGF-β1、α-SMA、胶原Ⅳ的表达情况；8.检测大鼠肾组织匀浆中H2O2、MDA含量及抗氧化酶CAT、SOD酶活性。研究结果1.GSPE对于各组大鼠体重、收缩压的影响：随着大鼠周龄的增长,各组大鼠体重呈逐渐增长趋势,但4组大鼠间体重无明显差异(P>0.05)。经过22周治疗后,SHR各组血压仍明显高于WKY组,但SHR大鼠各组间血压并无明显差异(P>0.05)。2.GSPE对于大鼠肾功能的影响：与WKY-C组相比,SHR各组的24小时尿蛋白总量、尿微量白蛋白水平都明显升高(P<0.01)。与SHR-C组相比,SHR-L组及SHR-H组的尿蛋白总量都降低(P<0.05或P<0.01),但SHR-L与SHR-H两组间没有差异(P>0.05)。至于24小时尿微量白蛋白,与SHR-C及SHR-L组相比,SHR-H组明显降低(P<0.01)。肌酐清除率在各组间均无统计学差异(P>0.05)。3.GSPE对于大鼠肾组织形态学的影响：HE染色结果显示,SHR-C组肾脏的肾小管上皮细胞出现水肿及肾小管间质炎性细胞浸润呈灶状分布,无明显的肾小管萎缩。GSPE治疗后,炎性细胞浸润明显减少,肾小管上皮细胞水肿也有不同程度减轻,治疗效果呈现出剂量依赖性,SHR-H组治疗效果更加明显。PAS染色结果显示,WKY-C组大鼠肾小球结构正常。SHR-C组大鼠可见基底膜区基质轻-中度沉积,系膜区增宽,个别肾小球的球囊壁肥厚较明显；SHR-L组大鼠系膜区也有基质轻度沉积,系膜区稍有增宽,球囊壁略有增生肥厚；SHR-H组大鼠系膜区基质轻度沉积,但较SHR-L组相比,沉积量减少,球囊壁厚度基本正常。Masson染色结果显示,WKY-C组肾间质出现极少量胶原呈线性分布,SHR-C及SHR-L组肾间质出现片状纤维化,SHR-H组肾间质纤维化则少量弥散分布在肾小球、肾小管周围。电镜下观察发现,WKY-C组大鼠肾小球滤过膜三层结构清晰可见,足细胞形态规整,内皮细胞窗孔清晰,基底膜厚度边缘清晰、均匀一致无增厚；SHR-C组可见基底膜多处不规则增厚,足细胞融合较多见,。足细胞内吞噬小泡增多；SHR-L组可见局灶的基底膜增厚,部分足细胞形态不规则,趋于融合；SHR-H组滤过膜结构接近正常。4.GSPE对于大鼠肾脏炎症的作用：与WKY-C组大鼠相比,SHR各组的IL-6及TNF-α蛋白、mRNA含量都明显升高(P<0.01)。与SHR-C组相比,经过治疗后的SHR-L、SHR-H组TNF-α、IL-6的蛋白及mRNA含量不同程度地降低,总体来说,降低程度呈剂量依赖性。接着我们通过Western blot检测了NF-κB亚基p65的磷酸化蛋白及总蛋白表达情况。在SHR各组中p-p65表达明显高于WKY-C组(P<0.01),p-p65蛋白水平自SHR-C组、SHR-L组到SHR-H组逐渐降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。5.GSPE对于大鼠肾脏纤维化的作用：免疫组化染色显示,TGF-β 1、胶原Ⅳ及α-SMA在SHR各组表达均高于WKY-C组。经过GSPE治疗,TGF-β1表达明显减少(P<0.01),但是SHR-L组与SHR-H组间的差异无统计学意义(P>0.05)；胶原Ⅳ表达也明显减少(P<0.01),并且呈现明显的剂量相关性；但是对于α-SMA,仅高剂量GSPE治疗时,其表达量较SHR-C组表达有所降低(P<0.05)。6.GSPE对于大鼠肾脏氧化应激水平的影响：与WKY-C组大鼠肾脏相比,SHR各组的H2O2、MDA水平都明显升高(P<0.01)。GSPE治疗后,H202、MDA水平降低,但是SHR-L组与SHR-H组间差异并无统计学意义(P>0.05)。与WKY-C组相比,SHR-C组的SOD水平下降,而经过GSPE长时间的处理后SHR大鼠肾脏内的SOD水平明显高于了WKY-C体内的水平(P<0.01)。CAT水平在SHR各组均不同程度地低于WKY-C组。GSPE处理后CAT水平升高,这种现象在SHR-H组更明显(P<0.05)。结论1.43周龄高血压大鼠肾脏出现炎性细胞浸润、间质纤维化、基底膜增厚、足突部分融合等病理改变,症状表现为蛋白尿、微量白蛋白尿,但肾功仍然正常。GSPE治疗显著改善上述病变。2.GSPE可以通过改善大鼠肾脏内氧化应激水平减轻肾脏炎症、纤维化,最终达到肾脏保护效应。