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第一部分CASK及其相互作用蛋白APBA1,STXBP1在胰岛素分泌及2型糖尿病中的作用研究目的:钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶（Calcium/calmodulin dependent serine protein kinase CASK）是膜相关鸟苷酸激酶家族中的一员。CASK存在多个蛋白质结构域,既往的研究中发现CASK可以通过这些结构域与不同的蛋白结合,行使其生物学功能。本研究中我们通过挖掘CASK在胰岛素分泌过程中的相互作用蛋白,进一步了解CASK在胰岛素分泌过程中的作用;此外我们还将探讨CASK及其相互作用蛋白在2型糖尿病中的作用。方法:免疫共沉淀联合液相质谱串联技术挖掘出INS-1细胞胰岛素分泌过程中CASK的相互结合蛋白。通过生物信息学的方法进一步筛选出能与CASK相互作用共同参与胰岛素分泌的蛋白。免疫荧光观察在胰岛素分泌过程中CASK及其相互作用蛋白细胞定位的分布及共定位情况。膜质组份分析胰岛素分泌过程中CASK及其相互作用蛋白在细胞膜和细胞质中的分布。合成CASK siRNA,构建胰岛β细胞CASK特异性敲除鼠;分析在CASK敲除或敲降情况下对其相互作用蛋白的影响。棕榈酸处理INS-1或构建高脂喂养下的2型糖尿病小鼠模型,观察在高脂诱导的2型糖尿病模型下CASK及其相互作用蛋白的表达情况,并观察过表达CASK是否可以通过与其相互蛋白作用补救高脂引起的胰岛素分泌受损。结果:1.在INS-1细胞中,使用高钾处理不同时间,随后用免疫共沉淀联合液相质谱串联技术一共挖掘出154个能与CASK在胰岛素分泌时相互作用的蛋白。2.通过对CASK相互作用蛋白的生物学事件、分子功能、细胞内定位的基因本体论分析,以及蛋白-蛋白相互作用分析最终得到11个最有可能在胰岛素分泌过程中与CASK发生相互作用的蛋白,其中APBA1,STXBP1已被既往的研究证实可以参与胰岛素的分泌,并且在神经递质囊泡分泌的时候能与CASK形成三元复合物。3.通过免疫共沉淀证实胰岛素释放时APBA1、STXBP1、CASK形成三元复合物。4.通过免疫荧光及细胞膜质组份分析,我们发现CASK可以促进APBA1与STXBP1的结合,并且CASK介导了 APBA1、STXBP1在胰岛素分泌时向细胞膜的移动。5.CASK、APBA1、STXBP1三元复合物异常可以导致胰岛素分泌障碍。6.CASK、STXBP1、APBA1在高脂处理的INS-1细胞和高脂诱导的糖尿病小鼠胰岛中表达降低。7.在高脂处理的INS-1/INS-1E细胞中过表达CASK可以促进CASK、STXBP1、APBA1三元复合物的功能,进而补救高脂诱导的胰岛素分泌受损。结论:CASK与APAB1,STXBP1在胰岛素分泌时可以形成三元复合物,并且CASK可以促进APAB1与STXBP1结合。在胰岛素分泌时,CASK介导了 APAB1,STXBP1向细胞膜的移动。胰岛或胰岛β细胞中的CASK,APBA1,STXBP1在高脂及糖尿病病理状态下表达降低。过表达CASK可以促进CASK、STXBP1、APBA1三元复合物的功能进而补救高脂诱导的胰岛素分泌受损第二部分miR-139-5p通过调控NPTX1介导高脂引起的胰岛素分泌受损目的:高脂能损伤胰岛β细胞释放胰岛素的能力,但是具体的机制仍不十分清楚。既往的研究证实miR-139-5p在糖尿病的胰腺组织中表达升高。但是对于miR-139-5p是否能参与高脂引起的胰岛素分泌受损,至今尚不明确。在本研究中,我们将探讨miR-139-5p是否可以参与高脂引起的胰岛素分泌受损,并寻找其可能的潜在下游靶点。方法:使用棕榈酸处理INS-1细胞在细胞上构建高脂损伤模型;通过高脂饲料喂养构建2型糖尿病小鼠模型。通过荧光定量PCR来检测miR-139-5p的表达量。使用生物信息学的方法来预测miR-139-5p的可能下游靶点,并通过荧光素酶报告基因实验来证实。蛋白印迹法来检测NPTX1的表达情况。使用Lipo8000、LipofectamineRNAMAX等转染试剂瞬时转染miR-139-5p mimic/inhibitor,pEGFP-N2-Nptx1质粒,NPTX1 siRNA。高钾刺激INS-1或者葡萄糖刺激INS-1E细胞释放胰岛素,并通过胰岛素放免法检测胰岛素分泌情况。结果:1.在高脂处理的INS-1细胞及高脂喂养小鼠的胰岛中miR-139-5p表达增加。2.使用Targetscan预测出NPTX1是miR-139-5p的下游靶基因,通过荧光素酶报告基因实验证实了 miR-139-5p可以与NPTX1 3’UTR区域结合。转染miR-139-5p后INS-1细胞中NPXT1表达降低,证实miR-139-5p可以负性调控NPTX1。3.高脂病理条件下NPTX1表达降低,并且在高脂病理条件下,NPTX1仍受miR-139-5p的调控。4.在INS-1或INS-1E细胞中过表达miR-139-5p或者敲降NPTX1后能引起胰岛素分泌受损。5.在高脂处理的INS-1细胞中过表达NPTX1可以补救高脂引起的胰岛素分泌受损;但这种补救作用在NPTX1过表达质粒与miR-139-5p mimic共同转染时失效。6.在高脂处理的INS-1细胞中敲降miR-139-5p可以补救高脂引起的胰岛素分泌受损;但这种补救作用在miR-139-5p inhibitor与NPTX1 siRNA共同转染时失效。结论:miR-139-5p在高脂病理状态下升高,而NPTX1则降低。NPTX1是miR-139-5p的下游靶基因,且受到miR-139-5p的负性调节。miR-139-5p,至少在一定程度上,可以通过介导NPTX1参与高脂引起的胰岛素分泌受损。